供体特异性 B 细胞的鉴定和抗体介导的排斥反应

致敏的患者，其面板反应性抗体 (PRA) > 20%，在等待名单上构成不成比例且不断增加的集群 (33%)，并且与未致敏的患者相比，他们必须等待更长的时间才能接受移植。 到等候名单上的 36 个月时，10% 的人在接受移植前死亡。 那些接受移植的人需要脱敏。 目前的脱敏方案包括用于去除 B 细胞的抗 CD20 单克隆抗体、用于去除浆细胞和血浆交换的蛋白酶体抑制剂和/或用于去除预先形成的供体特异性抗体 (DSA) 的静脉内免疫球蛋白 (IVIG)。 这些协议的成功可以使用单抗原珠 (SAB) luminex 技术来衡量。 这些脱敏方案已被证明可以显着降低平均荧光强度 (MFI)。 脱敏方案通常比识别 HLA II 类分子的抗体更有效地去除识别 HLA I 类分子的抗体。 不幸的是，即使在预处理之后，与移植前没有供体特异性抗体的患者相比，致敏患者更容易发生抗体介导的排斥反应 (ABMR)。 目前，DSA 的血清水平是在脱敏后测量的，而不是供体特异性 B 细胞 (DSB)。 B 细胞和/或浆细胞可能在治疗后残留。 供体特异性 B 细胞在移植和伴随的抗原暴露后，可以被重新刺激以产生抗体并发育成产生抗体的浆细胞。 因此，确定脱敏是否成功的一种可能更好的方法是使用上述 SAB 技术查看 DSA 级别，并查看 DSB 以确定这些单元格是否已被脱敏协议充分清除。

具体目标 1 假设：血清 DSA 有足够清除率但仍有大量 DSB 的患者更有可能发展为 ABMR。

在特定目标 1 中，研究人员将利用尖端技术通过用 HLA I 类四聚体染色 DSB 来观察致敏患者体内存在的抗 HLA 抗体水平，尤其是供体特异性抗体。 这种方法允许枚举和表征 DSA 的来源，即 DSB。 研究人员将确定脱敏前后以及移植后的 DSB 和供体特异性浆细胞 (DSPC) 的数量。 此外，研究人员还将观察移植前和移植后 DSB 的表型和激活状态。 HLA I 类四聚体是特定等位基因的 MHC I 类分子，其在肽结合槽中与肽重折叠，在 C 末端尾部生物素化，并使用与荧光团（如藻红蛋白 (PE)）缀合的链霉亲和素四聚化。 同样，HLA II 类四聚体由 MHC II 类等位基因组成。 B 细胞保留膜结合抗体，该抗体与它也产生的可溶性抗体具有确切的特异性。 四聚体将仅与表面具有针对特定 HLA I 类等位基因抗体的 B 细胞结合，因为结合仅由抗体的特异性决定。 同时，细胞将与其他标记物一起染色，以确定 DSB 的激活状态和表型。 该测定使用流式细胞术完成。 此外，研究人员将在所有时间点通过 Elisa 测量 BAFF 和 APRIL 细胞因子水平。 这些细胞因子与 B 细胞发育密切相关。 有数据表明，某些形式的脱敏后 BAFF 会升高，这可能会促进新 B 细胞的发育。

具体目标 1 假设：血清 DSA 有足够清除率但仍有大量 DSB 的患者更有可能发展为 ABMR。

在特定目标 1 中，研究人员将利用尖端技术通过用 HLA I 类四聚体染色 DSB 来观察致敏患者体内存在的抗 HLA 抗体水平，尤其是供体特异性抗体。 这种方法允许枚举和表征 DSA 的来源，即 DSB。 研究人员将确定脱敏前后以及移植后的 DSB 和供体特异性浆细胞 (DSPC) 的数量。 此外，研究人员还将观察移植前和移植后 DSB 的表型和激活状态。 HLA I 类四聚体是特定等位基因的 MHC I 类分子，其在肽结合槽中与肽重折叠，在 C 末端尾部生物素化，并使用与荧光团（如藻红蛋白 (PE)）缀合的链霉亲和素四聚化。 同样，HLA II 类四聚体由 MHC II 类等位基因组成。 B 细胞保留膜结合抗体，该抗体与它也产生的可溶性抗体具有确切的特异性。 四聚体将仅与表面具有针对特定 HLA I 类等位基因抗体的 B 细胞结合，因为结合仅由抗体的特异性决定。 同时，细胞将与其他标记物一起染色，以确定 DSB 的激活状态和表型。 该测定使用流式细胞术完成。 此外，我们将在所有时间点通过 Elisa 测量 BAFF 和 APRIL 细胞因子水平。 这些细胞因子与 B 细胞发育密切相关。 有数据表明，某些形式的脱敏后 BAFF 会升高，这可能会促进新 B 细胞的发育。

一旦获得同意，研究人员将从受试者那里抽血，并利用该样本建立 B 细胞的基线，这些 B 细胞产生的抗体可识别与先前通过 SAS 抗 HLA 抗体分析确定的类型相同的 HLA I 类四聚体。 在患者接受移植之前和之后，将重复 SAB 抗 HLA 抗体分析、四聚体分析和 BAFF/APRIL Elisas。 分析也将在移植后 6 周至 2 个月之间进行。

具体目标 2 假设：在慢性排斥反应期间，对脱敏反应良好且脱敏后能够保持耐受的患者将有较少的残留 DSB。

在特定目标 2 中，当患者因 ABMR 出现慢性排斥反应时，研究人员将利用相同的技术来量化和表征 DSA 和 DSB。 在这种情况下，患者在移植时可能没有 DSA，但在移植后发生了新发 DSA (dnDSA)，从而导致排斥反应。 或者患者可能有 DSA，成功脱敏，维持一段时间的耐受性，然后失去耐受性或发展为 dnDSA。 时间表将类似于特定目标 1 - 研究人员将在以下时间点采集样本：诊断 ABMR 后，脱敏后 1 周，然后脱敏后 2 至 3 个月以寻找反弹。

除了招募新的受试者外，研究者还将招募健康的正常人作为对照。