A donorspecifikus B-sejtek azonosítása és az antitest által közvetített kilökődés

Azok a szenzitizált betegek, akiknél a panelreaktív antitestek (PRA) > 20%, aránytalanul nagy és növekvő csoportot alkotnak a várólistán (33%), és tovább kell várniuk a transzplantációra, mint a nem szenzitizált betegeknek. A várólistán szereplő 36 hónapig 10%-uk halt meg a transzplantáció előtt. Azok, akik átültetést kapnak, deszenzitizációt igényelnek. A jelenlegi deszenzitizációs protokollok közé tartozik az anti-CD20 monoklonális antitest a B-sejtek eltávolítására, a proteaszóma inhibitor a plazmasejtek eltávolítására és a plazmacsere és/vagy az intravénás immunglobulin (IVIG) az előre kialakított donorspecifikus antitestek (DSA) eltávolítására. Ezeknek a protokolloknak a sikere egy antigén gyöngy (SAB) luminex technológiával mérhető. Ezekről a deszenzitizációs protokollokról kimutatták, hogy jelentősen csökkentik az átlagos fluoreszcencia intenzitást (MFI). A deszenzitizációs protokollok jellemzően hatékonyabbak a HLA I. osztályú molekulákat felismerő antitestek eltávolításában, mint azok, amelyek felismerik a HLA II. osztályú molekulákat. Sajnos az érzékeny betegeknél még az előkondicionálás után is nagyobb valószínűséggel alakul ki antitest által közvetített kilökődés (ABMR), mint azoknál, akiknél a transzplantáció előtt nem áll rendelkezésre donorspecifikus antitest. Jelenleg a DSA szérumszintjét mérik deszenzitizálás után, de nem a donorspecifikus B-sejteket (DSB). Lehetséges, hogy B-sejtek és/vagy plazmasejtek maradnak a kezelés után. A donorspecifikus B-sejtek a transzplantáció és az ezzel járó antigénexpozíció után újra stimulálhatók, hogy antitestet termeljenek, és antitestet termelő plazmasejtekké fejlődjenek. Ezért potenciálisan jobb módszer annak meghatározására, hogy a deszenzitizáció sikeres volt-e, ha megvizsgáljuk mind a DSA-szintet a fent leírt SAB-technológiával, mind a DSB-t annak megállapítására, hogy ezeket a sejteket megfelelően törölték-e a deszenzitizációs protokoll.

1. specifikus cél hipotézis: Azoknál a betegeknél, akiknél megfelelő a szérum DSA clearance-e, de még mindig jelentős a DSB populációja, nagyobb valószínűséggel alakul ki ABMR.

Az 1. specifikus célban a kutatók a legmodernebb technológiát alkalmazzák a szenzitizált betegekben jelen lévő anti-HLA antitestek, különösen donorspecifikus antitestek szintjének megfigyelésére oly módon, hogy a DSB-t HLA I. osztályú tetramerekkel festik meg. Ez a módszer lehetővé teszi a DSA forrásának, a DSB-nek a felsorolását és jellemzését. A kutatók meghatározzák a DSB- és donorspecifikus plazmasejtek (DSPC) számát a deszenzitizálás előtt és után, valamint később a transzplantáció után. Ezenkívül a kutatók megvizsgálják a DSB fenotípusát és aktiválási állapotát a transzplantáció előtt és a transzplantáció után. A HLA I. osztályú tetramerek egy adott allél MHC I. osztályú molekulái, amelyeket a peptidkötő barázdában egy peptiddel újra hajtogatnak, a C-terminális farkán biotinileznek, és fluoroforhoz, például fikoeritrinhez (PE) konjugált sztreptavidin alkalmazásával tetramerizálják. Hasonlóképpen, a HLA II. osztályú tetramerek MHC II. osztályú allélokból készülnek. A B-sejtek megtartják a membránhoz kötött antitesteket, amelyek pontosan megegyeznek az általa termelt oldható antitestekkel. A tetramerek csak azokhoz a B-sejtekhez kötődnek, amelyek felszínén antitestek vannak az adott HLA I. osztályú allél ellen, mivel a kötődést csak az ellenanyag specificitása határozza meg. Ugyanakkor a sejteket más markerekkel megfestik, hogy meghatározzák a DSB aktiválási állapotát és fenotípusát. Ezt a vizsgálatot áramlási citometriával végezzük. Ezenkívül a kutatók minden időpontban mérni fogják a BAFF és APRIL citokinszinteket az Elisa által. Ezek a citokinek szorosan kapcsolódnak a B-sejtek fejlődéséhez. Vannak adatok, amelyek arra utalnak, hogy a BAFF-szint emelkedett bizonyos deszenzitizációs formák után, ami elősegítheti az új B-sejtek fejlődését.

1. specifikus cél hipotézis: Azoknál a betegeknél, akiknél megfelelő a szérum DSA clearance-e, de még mindig jelentős a DSB populációja, nagyobb valószínűséggel alakul ki ABMR.

Az 1. specifikus célban a kutatók a legmodernebb technológiát alkalmazzák a szenzitizált betegekben jelen lévő anti-HLA antitestek, különösen donorspecifikus antitestek szintjének megfigyelésére oly módon, hogy a DSB-t HLA I. osztályú tetramerekkel festik meg. Ez a módszer lehetővé teszi a DSA forrásának, a DSB-nek a felsorolását és jellemzését. A kutatók meghatározzák a DSB- és donorspecifikus plazmasejtek (DSPC) számát a deszenzitizálás előtt és után, valamint később a transzplantáció után. Ezenkívül a kutatók megvizsgálják a DSB fenotípusát és aktiválási állapotát a transzplantáció előtt és a transzplantáció után. A HLA I. osztályú tetramerek egy adott allél MHC I. osztályú molekulái, amelyeket a peptidkötő barázdában egy peptiddel újra hajtogatnak, a C-terminális farkán biotinileznek, és fluoroforhoz, például fikoeritrinhez (PE) konjugált sztreptavidin alkalmazásával tetramerizálják. Hasonlóképpen, a HLA II. osztályú tetramerek MHC II. osztályú allélokból készülnek. A B-sejtek megtartják a membránhoz kötött antitesteket, amelyek pontosan megegyeznek az általa termelt oldható antitestekkel. A tetramerek csak azokhoz a B-sejtekhez kötődnek, amelyek felszínén antitestek vannak az adott HLA I. osztályú allél ellen, mivel a kötődést csak az ellenanyag specificitása határozza meg. Ugyanakkor a sejteket más markerekkel megfestik, hogy meghatározzák a DSB aktiválási állapotát és fenotípusát. Ezt a vizsgálatot áramlási citometriával végezzük. Ezenkívül az Elisa minden időpontban megméri a BAFF és APRIL citokinszinteket. Ezek a citokinek szorosan kapcsolódnak a B-sejtek fejlődéséhez. Vannak adatok, amelyek arra utalnak, hogy a BAFF-szint emelkedett bizonyos deszenzitizációs formák után, ami elősegítheti az új B-sejtek fejlődését.

A vizsgálók a beleegyezés megszerzése után vért vesznek az alanyoktól, és ezt a mintát felhasználják azon B-sejtek alapvonalának megállapítására, amelyek olyan antitesteket termelnek, amelyek felismerik az SAS anti-HLA antitest-analízissel korábban azonosítottakkal azonos típusú HLA I. osztályú tetramereket. Közvetlenül a beteg átültetése előtt és után megismétlik a SAB anti-HLA antitest-analízist, a tetramer elemzést és a BAFF/APRIL Elisas-t. Az elemzéseket az átültetést követő 6 hét és 2 hónap között is elvégzik.

2. specifikus cél hipotézis: A krónikus kilökődés során azoknál a betegeknél, akik jól reagálnak a deszenzitizációra, és képesek fenntartani a toleranciát a deszenzitizáció után, kevesebb lesz a maradék DSB.

A 2. specifikus célban a vizsgálók ugyanazt a technológiát alkalmazzák a DSA és a DSB számszerűsítésére és jellemzésére, amikor a páciens ABMR miatt krónikus kilökődést tapasztal. Ebben az esetben előfordulhat, hogy a betegben nem volt DSA a transzplantáció során, de a transzplantáció után de novo DSA (dnDSA) alakult ki, ami kilökődést okozott. Vagy előfordulhat, hogy a betegnek DSA-ja volt, sikeresen deszenzitizálták, toleranciája bizonyos ideig megmaradt, majd elvesztette toleranciáját, vagy dnDSA fejlődött ki. Az idővonalak hasonlóak az 1. konkrét célhoz – a vizsgálók a következő időpontokban vesznek mintát: ABMR diagnosztizálása után, 1 héttel a deszenzitizáció után, majd 2-3 hónappal a deszenzitizálás után, hogy keressenek visszapattanást.

Az új alanyok felvétele mellett a vizsgálók egészséges, normál egyéneket is besorolnak kontrollként.