Identifikation af donorspecifikke B-celler og antistofmedieret afvisning

Sensibiliserede patienter, som har panelreaktive antistoffer (PRA) > 20 %, udgør en uforholdsmæssig og stigende klynge på ventelisten (33 %) og skal vente længere på at få en transplantation end ikke-sensibiliserede patienter. Efter 36 måneder på ventelisten døde 10 % før de modtog en transplantation. De, der modtager transplantationer, kræver desensibilisering. De nuværende desensibiliseringsprotokoller inkluderer anti-CD20 monoklonalt antistof til fjernelse af B-celler, en proteasomhæmmer til eliminering af plasmaceller og plasmaudveksling og/eller intravenøst ​​immunglobulin (IVIG) til fjernelse af præformede donorspecifikke antistoffer (DSA). Succesen med disse protokoller kan måles ved hjælp af single antigen bead (SAB) luminex-teknologi. Disse desensibiliseringsprotokoller har vist sig at reducere den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) signifikant. Desensibiliseringsprotokoller er typisk mere effektive til at fjerne antistoffer, der genkender HLA Klasse I-molekyler, end dem, der genkender HLA Klasse II-molekyler. Desværre, selv efter prækonditionering, er sensibiliserede patienter mere tilbøjelige til at udvikle antistofmedieret afstødning (ABMR) end patienter, der ikke har donorspecifikke antistoffer før transplantation. I øjeblikket måles serumniveauer af DSA efter desensibilisering, men ikke donorspecifikke B-celler (DSB). Det er muligt, at B-celler og/eller plasmaceller forbliver efter behandling. Donorspecifikke B-celler kan efter transplantation og den medfølgende eksponering for antigen genstimuleres til både at producere antistof og også til at udvikle sig til plasmaceller, der producerer antistof. Derfor ville et potentielt bedre middel til at afgøre, om desensibilisering har været vellykket, være at se på både DSA-niveauet ved hjælp af SAB-teknologi som beskrevet ovenfor og at se på DSB for at afgøre, om disse celler er blevet tilstrækkeligt clearet af desensibiliseringsprotokollen.

Specifik mål 1-hypotese: Patienter, som har tilstrækkelig clearance af serum DSA, men som stadig har signifikante populationer af DSB, er mere tilbøjelige til at udvikle ABMR.

I Specifikt mål 1 vil efterforskerne bruge banebrydende teknologi til at observere niveauer af anti-HLA-antistoffer, især donorspecifikke antistoffer, til stede i sensibiliserede patienter ved at farve DSB med HLA klasse I tetramere. Denne metode tillader opregning og karakterisering af kilden til DSA, DSB. Efterforskerne vil bestemme antallet af DSB og donorspecifikke plasmaceller (DSPC) før og efter desensibilisering samt senere efter transplantation. Derudover vil efterforskerne se på fænotypen og aktiveringstilstanden af ​​DSB før transplantation og efter transplantation. HLA klasse I tetramerer er MHC klasse I molekyler af en bestemt allel, som genfoldes med et peptid i peptidbindingsrillen, biotinyleres på den C terminale hale og tetrameriseres under anvendelse af streptavidin konjugeret til en fluorofor såsom phycoerythrin (PE). Tilsvarende er HLA klasse II tetramerer lavet af MHC klasse II alleler. B-celler bevarer membranbundet antistof, som har den nøjagtige specificitet af de opløselige antistoffer, som det også producerer. Tetramererne vil kun binde til B-celler, der har antistoffer mod den specifikke HLA klasse I allel på overfladen, da bindingen kun bestemmes af antistoffets specificitet. På samme tid vil cellerne blive farvet med andre markører for at bestemme aktiveringstilstanden og fænotypen af ​​DSB. Denne analyse udføres ved hjælp af flowcytometri. Derudover vil efterforskerne måle BAFF- og APRIL-cytokinniveauer af Elisa på alle tidspunkter. Disse cytokiner er tæt beslægtet med B-celleudvikling. Der er data, der tyder på, at BAFF er forhøjet efter nogle former for desensibilisering, hvilket kan forbedre udviklingen af ​​nye B-celler.

Specifik mål 1-hypotese: Patienter, som har tilstrækkelig clearance af serum DSA, men som stadig har signifikante populationer af DSB, er mere tilbøjelige til at udvikle ABMR.

I Specifikt mål 1 vil efterforskerne bruge banebrydende teknologi til at observere niveauer af anti-HLA-antistoffer, især donorspecifikke antistoffer, til stede i sensibiliserede patienter ved at farve DSB med HLA klasse I tetramere. Denne metode tillader opregning og karakterisering af kilden til DSA, DSB. Efterforskerne vil bestemme antallet af DSB og donorspecifikke plasmaceller (DSPC) før og efter desensibilisering samt senere efter transplantation. Derudover vil efterforskerne se på fænotypen og aktiveringstilstanden af ​​DSB før transplantation og efter transplantation. HLA klasse I tetramerer er MHC klasse I molekyler af en bestemt allel, som genfoldes med et peptid i peptidbindingsrillen, biotinyleres på den C terminale hale og tetrameriseres under anvendelse af streptavidin konjugeret til en fluorofor såsom phycoerythrin (PE). Tilsvarende er HLA klasse II tetramerer lavet af MHC klasse II alleler. B-celler bevarer membranbundet antistof, som har den nøjagtige specificitet af de opløselige antistoffer, som det også producerer. Tetramererne vil kun binde til B-celler, der har antistoffer mod den specifikke HLA klasse I allel på overfladen, da bindingen kun bestemmes af antistoffets specificitet. På samme tid vil cellerne blive farvet med andre markører for at bestemme aktiveringstilstanden og fænotypen af ​​DSB. Denne analyse udføres ved hjælp af flowcytometri. Derudover vil vi måle BAFF- og APRIL-cytokinniveauer af Elisa på alle tidspunkter. Disse cytokiner er tæt beslægtet med B-celleudvikling. Der er data, der tyder på, at BAFF er forhøjet efter nogle former for desensibilisering, hvilket kan forbedre udviklingen af ​​nye B-celler.

Efterforskerne vil tage en blodprøve fra forsøgspersoner, når samtykke er opnået, og bruge denne prøve til at etablere en baseline af B-celler, der producerer antistoffer, der genkender HLA klasse I tetramerer af samme type som dem, der tidligere er identificeret ved SAS anti-HLA antistofanalyse. Umiddelbart før og efter, at patienten modtager en transplantation, gentages SAB anti-HLA antistofanalysen, tetrameranalysen og BAFF/APRIL Elisas. Analyser vil også blive udført mellem 6 uger og 2 måneder efter transplantationen.

Specifik mål 2 Hypotese: Under kronisk afstødning vil patienter, der reagerer godt på desensibilisering, og som er i stand til at opretholde tolerance efter desensibilisering, have færre resterende DSB.

I Specifikt mål 2 vil efterforskerne bruge den samme teknologi til at kvantificere og karakterisere DSA og DSB, når en patient oplever kronisk afstødning på grund af ABMR. I dette tilfælde kan patienten ikke have haft DSA ved transplantation, men udviklet de novo DSA (dnDSA) efter transplantation, hvilket forårsager afstødning. Eller patienten kan have haft DSA, været desensibiliseret med succes, bevaret tolerancen i en periode, derefter enten mistet tolerancen eller udviklet dnDSA. Tidslinjerne vil ligne specifikt mål 1 - efterforskerne vil tage prøver på følgende tidspunkter: ved diagnose af ABMR, 1 uge efter desensibilisering, derefter 2 til 3 måneder efter desensibilisering for at se efter rebound.

Ud over tilmelding af nye forsøgspersoner vil efterforskerne også indskrive raske normale individer til at fungere som kontroller.