Identifikasjon av donorspesifikke B-celler og antistoffmediert avvisning

Pasienter som er sensibiliserte, som har panelreaktive antistoffer (PRA) > 20 %, utgjør en uforholdsmessig og økende klynge på ventelisten (33 %), og må vente lenger på å få en transplantasjon enn ikke-sensibiliserte pasienter. Etter 36 måneder på ventelisten døde 10 % før de ble transplantert. De som mottar transplantasjoner krever desensibilisering. De nåværende desensibiliseringsprotokollene inkluderer anti-CD20 monoklonalt antistoff for å fjerne B-celler, en proteasomhemmer for å eliminere plasmaceller og plasmautveksling og/eller intravenøst ​​immunglobulin (IVIG) for å fjerne forhåndsdannede donorspesifikke antistoffer (DSA). Suksessen til disse protokollene kan måles ved hjelp av single antigen bead (SAB) luminex-teknologi. Disse desensibiliseringsprotokollene har vist seg å redusere gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) betydelig. Desensibiliseringsprotokoller er vanligvis mer effektive for å fjerne antistoffer som gjenkjenner HLA klasse I-molekyler enn de som gjenkjenner HLA klasse II-molekyler. Dessverre, selv etter forhåndskondisjonering, er det mer sannsynlig at sensibiliserte pasienter utvikler antistoffmediert avvisning (ABMR) enn pasienter som ikke har donorspesifikke antistoffer før transplantasjon. For tiden måles serumnivåer av DSA etter desensibilisering, men ikke donorspesifikke B-celler (DSB). Det er mulig at B-celler og/eller plasmaceller forblir etter behandling. Donorspesifikke B-celler, ved transplantasjon og den medfølgende eksponeringen for antigen, kan re-stimuleres til både å produsere antistoff og også til å utvikle seg til plasmaceller som produserer antistoff. Derfor, potensielt en bedre måte å avgjøre om desensibilisering har vært vellykket, ville være å se på både DSA-nivået ved bruk av SAB-teknologi som beskrevet ovenfor og å se på DSB for å finne ut om disse cellene har blitt tilstrekkelig klarert av desensibiliseringsprotokollen.

Spesifikk mål 1-hypotese: Pasienter som har tilstrekkelig clearance av serum DSA, men som fortsatt har betydelige populasjoner av DSB, er mer sannsynlig å utvikle ABMR.

I spesifikt mål 1 vil etterforskerne bruke banebrytende teknologi for å observere nivåer av anti-HLA-antistoffer, spesielt donorspesifikke antistoffer, tilstede hos sensibiliserte pasienter ved å farge DSB med HLA klasse I tetramerer. Denne metoden tillater oppregning og karakterisering av kilden til DSA, DSB. Etterforskerne vil bestemme antall DSB og donorspesifikke plasmaceller (DSPC) før og etter desensibilisering samt senere etter transplantasjon. I tillegg vil etterforskerne se på fenotypen og aktiveringstilstanden til DSB før transplantasjon og etter transplantasjon. HLA klasse I tetramerer er MHC klasse I molekyler av en bestemt allel som er refoldet med et peptid i peptidbindingssporet, biotinylert på C terminal halen og tetramerisert ved bruk av streptavidin konjugert til en fluorofor som phycoerythrin (PE). Tilsvarende er HLA klasse II tetramerer laget av MHC klasse II alleler. B-celler beholder membranbundet antistoff som har nøyaktig spesifisiteten til de løselige antistoffene som det også produserer. Tetramerene vil bare binde seg til B-celler som har antistoffer mot den spesifikke HLA klasse I allelen på overflaten, siden bindingen kun bestemmes av spesifisiteten til antistoffet. Samtidig vil cellene farges med andre markører for å bestemme aktiveringstilstanden og fenotypen til DSB. Denne analysen gjøres ved hjelp av flowcytometri. I tillegg vil etterforskerne måle BAFF og APRIL cytokinnivåer av Elisa til enhver tid. Disse cytokinene er nært knyttet til B-celleutvikling. Det er data som tyder på at BAFF er forhøyet etter noen former for desensibilisering, noe som kan forbedre utviklingen av nye B-celler.

Spesifikk mål 1-hypotese: Pasienter som har tilstrekkelig clearance av serum DSA, men som fortsatt har betydelige populasjoner av DSB, er mer sannsynlig å utvikle ABMR.

I spesifikt mål 1 vil etterforskerne bruke banebrytende teknologi for å observere nivåer av anti-HLA-antistoffer, spesielt donorspesifikke antistoffer, tilstede hos sensibiliserte pasienter ved å farge DSB med HLA klasse I tetramerer. Denne metoden tillater oppregning og karakterisering av kilden til DSA, DSB. Etterforskerne vil bestemme antall DSB og donorspesifikke plasmaceller (DSPC) før og etter desensibilisering samt senere etter transplantasjon. I tillegg vil etterforskerne se på fenotypen og aktiveringstilstanden til DSB før transplantasjon og etter transplantasjon. HLA klasse I tetramerer er MHC klasse I molekyler av en bestemt allel som er refoldet med et peptid i peptidbindingssporet, biotinylert på C terminal halen og tetramerisert ved bruk av streptavidin konjugert til en fluorofor som phycoerythrin (PE). Tilsvarende er HLA klasse II tetramerer laget av MHC klasse II alleler. B-celler beholder membranbundet antistoff som har nøyaktig spesifisiteten til de løselige antistoffene som det også produserer. Tetramerene vil bare binde seg til B-celler som har antistoffer mot den spesifikke HLA klasse I allelen på overflaten, siden bindingen kun bestemmes av spesifisiteten til antistoffet. Samtidig vil cellene farges med andre markører for å bestemme aktiveringstilstanden og fenotypen til DSB. Denne analysen gjøres ved hjelp av flowcytometri. I tillegg vil vi måle cytokinnivåer av BAFF og APRIL av Elisa til enhver tid. Disse cytokinene er nært knyttet til B-celleutvikling. Det er data som tyder på at BAFF er forhøyet etter noen former for desensibilisering, noe som kan forbedre utviklingen av nye B-celler.

Etterforskerne vil ta blodprøver fra forsøkspersoner så snart samtykke er oppnådd og bruke denne prøven til å etablere en baseline av B-celler som produserer antistoffer som gjenkjenner HLA klasse I tetramerer av samme type som de tidligere identifisert ved SAS anti-HLA antistoffanalyse. Umiddelbart før og etter at pasienten mottar en transplantasjon, vil SAB anti-HLA antistoffanalyse, tetrameranalyse og BAFF/APRIL Elisas gjentas. Analyser vil også bli utført mellom 6 uker og 2 måneder etter transplantasjon.

Spesifikk mål 2 Hypotese: Ved kronisk avstøtning vil pasienter som responderer godt på desensibilisering og som er i stand til å opprettholde toleranse etter desensibilisering ha færre gjenværende DSB.

I Spesifikt mål 2 vil etterforskerne bruke samme teknologi for å kvantifisere og karakterisere DSA og DSB når en pasient opplever kronisk avvisning på grunn av ABMR. I dette tilfellet kan det hende at pasienten ikke har hatt DSA ved transplantasjon, men utviklet de novo DSA (dnDSA) etter transplantasjon, noe som forårsaket avvisning. Eller pasienten kan ha hatt DSA, blitt desensibilisert vellykket, opprettholdt toleransen i en periode, deretter enten mistet toleransen eller utviklet dnDSA. Tidslinjene vil være lik spesifikt mål 1 - etterforskerne vil ta prøver på følgende tidspunkt: ved diagnose av ABMR, 1 uke etter desensibilisering, deretter 2 til 3 måneder etter desensibilisering for å se etter rebound.

I tillegg til registrering av nye forsøkspersoner, vil etterforskerne også registrere friske normale individer for å tjene som kontroller.