Identyfikacja komórek B swoistych dla dawcy i odrzucanie za pośrednictwem przeciwciał

Pacjenci uczuleni, u których panel reaktywnych przeciwciał (PRA) > 20% stanowią nieproporcjonalną i rosnącą grupę na liście oczekujących (33%) i muszą czekać dłużej na przeszczep niż pacjenci nieuczuleni. Po 36 miesiącach na liście oczekujących 10% zmarło przed otrzymaniem przeszczepu. Ci, którzy otrzymują przeszczepy, wymagają odczulania. Obecne protokoły odczulania obejmują przeciwciało monoklonalne anty-CD20 w celu usunięcia limfocytów B, inhibitor proteasomu w celu wyeliminowania komórek plazmatycznych oraz wymianę osocza i/lub immunoglobulinę dożylną (IVIG) w celu usunięcia wstępnie utworzonych przeciwciał swoistych dla dawcy (DSA). Sukces tych protokołów można zmierzyć za pomocą technologii luminex z pojedynczym antygenem (SAB). Wykazano, że te protokoły odczulania znacznie zmniejszają średnią intensywność fluorescencji (MFI). Protokoły odczulania zazwyczaj są skuteczniejsze w usuwaniu przeciwciał, które rozpoznają cząsteczki HLA klasy I niż te, które rozpoznają cząsteczki HLA klasy II. Niestety, nawet po wstępnym kondycjonowaniu, uczuleni pacjenci są bardziej narażeni na odrzucenie za pośrednictwem przeciwciał (ABMR) niż pacjenci, którzy nie mają przeciwciał swoistych dla dawcy przed przeszczepem. Obecnie poziomy DSA w surowicy są mierzone po odczulaniu, ale nie komórki B swoiste dla dawcy (DSB). Możliwe, że komórki B i/lub komórki plazmatyczne pozostaną po leczeniu. Komórki B specyficzne dla dawcy, po przeszczepie i towarzyszącej ekspozycji na antygen, mogą być ponownie stymulowane zarówno do wytwarzania przeciwciał, jak i do rozwijania się w komórki plazmatyczne, które wytwarzają przeciwciała. Dlatego potencjalnie lepszym sposobem określenia, czy odczulanie było skuteczne, byłoby przyjrzenie się zarówno poziomowi DSA przy użyciu technologii SAB, jak opisano powyżej, jak i przyjrzeniu się DSB w celu określenia, czy te komórki zostały odpowiednio usunięte przez protokół odczulania.

Cel szczegółowy 1 Hipoteza: Pacjenci, u których występuje odpowiedni klirens DSA w surowicy, ale nadal występują znaczne populacje DSB, są bardziej narażeni na rozwój ABMR.

W Celu Szczegółowym 1 badacze wykorzystają najnowocześniejszą technologię do obserwacji poziomów przeciwciał anty-HLA, zwłaszcza przeciwciał swoistych dla dawcy, obecnych u uczulonych pacjentów poprzez barwienie DSB tetramerami HLA klasy I. Ta metoda pozwala na wyliczenie i scharakteryzowanie źródła DSA, DSB. Badacze określą liczbę DSB i komórek plazmatycznych specyficznych dla dawcy (DSPC) przed i po odczulaniu, a także później po przeszczepie. Ponadto badacze przyjrzą się fenotypowi i stanowi aktywacji DSB przed i po przeszczepie. Tetramery HLA klasy I to cząsteczki MHC klasy I określonego allelu, które są ponownie fałdowane z peptydem w rowku wiążącym peptyd, biotynylowane na C-końcowym ogonie i tetrameryzowane przy użyciu streptawidyny skoniugowanej z fluoroforem, takim jak fikoerytryna (PE). Podobnie, tetramery HLA klasy II są wykonane z alleli MHC klasy II. Komórki B zatrzymują przeciwciała związane z błoną, które mają dokładnie taką specyficzność jak rozpuszczalne przeciwciała, które również wytwarzają. Tetramery będą wiązać się tylko z komórkami B, które mają przeciwciała przeciwko temu specyficznemu allelowi HLA klasy I na powierzchni, ponieważ wiązanie jest określone tylko przez specyficzność przeciwciała. W tym samym czasie komórki będą barwione innymi markerami w celu określenia stanu aktywacji i fenotypu DSB. Test ten przeprowadza się za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto badacze będą mierzyć poziomy cytokin BAFF i APRIL metodą Elisa we wszystkich punktach czasowych. Te cytokiny są ściśle związane z rozwojem komórek B. Istnieją dane sugerujące, że poziom BAFF jest podwyższony po niektórych formach odczulania, co może przyspieszyć rozwój nowych limfocytów B.

Cel szczegółowy 1 Hipoteza: Pacjenci, u których występuje odpowiedni klirens DSA w surowicy, ale nadal występują znaczne populacje DSB, są bardziej narażeni na rozwój ABMR.

W Celu Szczegółowym 1 badacze wykorzystają najnowocześniejszą technologię do obserwacji poziomów przeciwciał anty-HLA, zwłaszcza przeciwciał swoistych dla dawcy, obecnych u uczulonych pacjentów poprzez barwienie DSB tetramerami HLA klasy I. Ta metoda pozwala na wyliczenie i scharakteryzowanie źródła DSA, DSB. Badacze określą liczbę DSB i komórek plazmatycznych specyficznych dla dawcy (DSPC) przed i po odczulaniu, a także później po przeszczepie. Ponadto badacze przyjrzą się fenotypowi i stanowi aktywacji DSB przed i po przeszczepie. Tetramery HLA klasy I to cząsteczki MHC klasy I określonego allelu, które są ponownie fałdowane z peptydem w rowku wiążącym peptyd, biotynylowane na C-końcowym ogonie i tetrameryzowane przy użyciu streptawidyny skoniugowanej z fluoroforem, takim jak fikoerytryna (PE). Podobnie, tetramery HLA klasy II są wykonane z alleli MHC klasy II. Komórki B zatrzymują przeciwciała związane z błoną, które mają dokładnie taką specyficzność jak rozpuszczalne przeciwciała, które również wytwarzają. Tetramery będą wiązać się tylko z komórkami B, które mają przeciwciała przeciwko temu specyficznemu allelowi HLA klasy I na powierzchni, ponieważ wiązanie jest określone tylko przez specyficzność przeciwciała. W tym samym czasie komórki będą barwione innymi markerami w celu określenia stanu aktywacji i fenotypu DSB. Test ten przeprowadza się za pomocą cytometrii przepływowej. Dodatkowo będziemy mierzyć poziomy cytokin BAFF i APRIL metodą Elisa we wszystkich punktach czasowych. Te cytokiny są ściśle związane z rozwojem komórek B. Istnieją dane sugerujące, że poziom BAFF jest podwyższony po niektórych formach odczulania, co może przyspieszyć rozwój nowych limfocytów B.

Badacze uzyskają pobranie krwi od pacjentów po uzyskaniu zgody i wykorzystają tę próbkę do ustalenia linii bazowej limfocytów B, które wytwarzają przeciwciała rozpoznające tetramery HLA klasy I tego samego typu, co te, które zostały wcześniej zidentyfikowane za pomocą analizy przeciwciał anty-HLA SAS. Bezpośrednio przed i po otrzymaniu przez pacjenta przeszczepu zostanie powtórzona analiza przeciwciał SAB anty-HLA, analiza tetramerów i BAFF/APRIL Elisas. Analizy zostaną również przeprowadzone w okresie od 6 tygodni do 2 miesięcy po przeszczepie.

Cel szczegółowy 2 Hipoteza: Podczas przewlekłego odrzucania, pacjenci, którzy dobrze reagują na odczulanie i którzy są w stanie utrzymać tolerancję po odczulaniu, będą mieli mniej pozostałości DSB.

W celu szczegółowym 2 badacze wykorzystają tę samą technologię do ilościowego określenia i scharakteryzowania DSA i DSB, gdy pacjent doświadcza przewlekłego odrzucenia z powodu ABMR. W tym przypadku pacjent mógł nie mieć DSA podczas przeszczepu, ale rozwinął się de novo DSA (dnDSA) po przeszczepie, powodując odrzucenie. Lub pacjent mógł mieć DSA, został skutecznie odczulony, utrzymywał tolerancję przez pewien czas, a następnie albo utracił tolerancję, albo rozwinął się dnDSA. Ramy czasowe będą podobne do celu szczegółowego 1 – badacze będą pobierać próbki w następujących punktach czasowych: po rozpoznaniu ABMR, 1 tydzień po odczulaniu, następnie 2 do 3 miesięcy po odczulaniu, aby sprawdzić odbicie.

Oprócz włączenia nowych pacjentów, badacze będą również rejestrować zdrowe, normalne osoby, które będą służyć jako kontrole.