Идентификация донор-специфических В-клеток и отторжение, опосредованное антителами

Сенсибилизированные пациенты, у которых уровень панельных реактивных антител (PRA) > 20%, составляют непропорциональную и растущую группу в списке ожидания (33%), и им приходится ждать трансплантации дольше, чем несенсибилизированным пациентам. К 36 месяцам в списке ожидания 10% умерли до трансплантации. Тем, кто получает трансплантаты, требуется десенсибилизация. Текущие протоколы десенсибилизации включают моноклональное антитело к CD20 для удаления В-клеток, ингибитор протеасом для устранения плазматических клеток и плазмаферез и/или внутривенный иммуноглобулин (ВВИГ) для удаления предварительно сформированных донорских специфических антител (ДСА). Успех этих протоколов можно измерить с помощью технологии luminex с одним антигенным шариком (SAB). Было показано, что эти протоколы десенсибилизации значительно снижают среднюю интенсивность флуоресценции (MFI). Протоколы десенсибилизации обычно более эффективны для удаления антител, которые распознают молекулы HLA класса I, чем те, которые распознают молекулы HLA класса II. К сожалению, даже после предварительного кондиционирования у сенсибилизированных пациентов более вероятно развитие опосредованного антителами отторжения (ABMR), чем у пациентов, у которых до трансплантации не было донорских специфических антител. В настоящее время после десенсибилизации измеряют сывороточные уровни DSA, но не донор-специфических В-клеток (DSB). Возможно, что после лечения остаются В-клетки и/или плазматические клетки. Донор-специфические В-клетки после трансплантации и сопутствующего воздействия антигена могут быть повторно стимулированы как для продукции антител, так и для развития в плазматические клетки, которые продуцируют антитела. Следовательно, потенциально лучшим способом определения того, была ли десенсибилизация успешной, было бы рассмотрение как уровня DSA с использованием технологии SAB, как описано выше, так и просмотра DSB, чтобы определить, были ли эти клетки адекватно очищены протоколом десенсибилизации.

Конкретная цель 1. Гипотеза. Пациенты с адекватным клиренсом DSA в сыворотке крови, но со значительной популяцией DSB, более склонны к развитию ABMR.

В Конкретной цели 1 исследователи будут использовать передовые технологии для наблюдения за уровнями анти-HLA-антител, особенно донор-специфических антител, присутствующих у сенсибилизированных пациентов, путем окрашивания DSB тетрамерами HLA класса I. Этот метод позволяет перечислить и охарактеризовать источник DSA, DSB. Исследователи определят количество DSB и донор-специфических плазматических клеток (DSPC) до и после десенсибилизации, а также позднее после трансплантации. Кроме того, исследователи изучат фенотип и состояние активации DSB до трансплантации и после трансплантации. Тетрамеры HLA класса I представляют собой молекулы MHC класса I определенного аллеля, которые рефолдированы с пептидом в пептидсвязывающей бороздке, биотинилированы на С-концевом хвосте и тетрамеризованы с использованием стрептавидина, конъюгированного с флуорофором, таким как фикоэритрин (PE). Точно так же тетрамеры HLA класса II состоят из аллелей MHC класса II. В-клетки сохраняют связанные с мембраной антитела, обладающие точной специфичностью растворимых антител, которые они также продуцируют. Тетрамеры будут связываться только с В-клетками, у которых есть антитела против этого специфического аллеля HLA класса I на поверхности, поскольку связывание определяется только специфичностью антитела. В то же время клетки будут окрашиваться другими маркерами для определения состояния активации и фенотипа DSB. Этот анализ проводится с использованием проточной цитометрии. Кроме того, исследователи будут измерять уровни цитокинов BAFF и APRIL с помощью ELISA во все моменты времени. Эти цитокины тесно связаны с развитием В-клеток. Имеются данные, позволяющие предположить, что BAFF повышается после некоторых форм десенсибилизации, что может способствовать развитию новых В-клеток.

Конкретная цель 1. Гипотеза. Пациенты с адекватным клиренсом DSA в сыворотке крови, но со значительной популяцией DSB, более склонны к развитию ABMR.

В Конкретной цели 1 исследователи будут использовать передовые технологии для наблюдения за уровнями анти-HLA-антител, особенно донор-специфических антител, присутствующих у сенсибилизированных пациентов, путем окрашивания DSB тетрамерами HLA класса I. Этот метод позволяет перечислить и охарактеризовать источник DSA, DSB. Исследователи определят количество DSB и донор-специфических плазматических клеток (DSPC) до и после десенсибилизации, а также позднее после трансплантации. Кроме того, исследователи изучат фенотип и состояние активации DSB до трансплантации и после трансплантации. Тетрамеры HLA класса I представляют собой молекулы MHC класса I определенного аллеля, которые рефолдированы с пептидом в пептидсвязывающей бороздке, биотинилированы на С-концевом хвосте и тетрамеризованы с использованием стрептавидина, конъюгированного с флуорофором, таким как фикоэритрин (PE). Точно так же тетрамеры HLA класса II состоят из аллелей MHC класса II. В-клетки сохраняют связанные с мембраной антитела, обладающие точной специфичностью растворимых антител, которые они также продуцируют. Тетрамеры будут связываться только с В-клетками, у которых есть антитела против этого специфического аллеля HLA класса I на поверхности, поскольку связывание определяется только специфичностью антитела. В то же время клетки будут окрашиваться другими маркерами для определения состояния активации и фенотипа DSB. Этот анализ проводится с использованием проточной цитометрии. Кроме того, мы будем измерять уровни цитокинов BAFF и APRIL с помощью ELISA во все моменты времени. Эти цитокины тесно связаны с развитием В-клеток. Имеются данные, позволяющие предположить, что BAFF повышается после некоторых форм десенсибилизации, что может способствовать развитию новых В-клеток.

Исследователи возьмут кровь у субъектов после получения согласия и используют этот образец для установления исходного уровня В-клеток, которые продуцируют антитела, распознающие тетрамеры HLA класса I того же типа, что и те, которые ранее были идентифицированы с помощью анализа антител SAS против HLA. Непосредственно до и после того, как пациент получит трансплантат, будет повторен анализ антител к SAB анти-HLA, анализ тетрамера и BAFF/APRIL Elisas. Анализы также будут проводиться в период от 6 недель до 2 месяцев после трансплантации.

Конкретная цель 2. Гипотеза: при хроническом отторжении пациенты, которые хорошо реагируют на десенсибилизацию и способны сохранять толерантность после десенсибилизации, будут иметь меньше остаточных DSB.

В Конкретной цели 2 исследователи будут использовать ту же технологию для количественного определения и характеристики DSA и DSB, когда пациент испытывает хроническое отторжение из-за ABMR. В этом случае у пациента, возможно, не было DSA при трансплантации, но у него развился de novo DSA (dnDSA) после трансплантации, что вызвало отторжение. Или у пациента может быть DSA, успешная десенсибилизация, сохраняющаяся толерантность в течение определенного периода времени, затем либо утраченная толерантность, либо развившаяся dnDSA. Сроки будут аналогичны конкретной цели 1 — исследователи будут брать образцы в следующие моменты времени: после постановки диагноза ABMR, через 1 неделю после десенсибилизации, затем через 2–3 месяца после десенсибилизации для выявления рикошета.

В дополнение к набору новых субъектов исследователи также будут набирать здоровых нормальных людей в качестве контроля.