Identificação de células B específicas do doador e rejeição mediada por anticorpos

Pacientes sensibilizados, com painel de anticorpos reativos (PRAs) > 20%, compõem um grupo desproporcional e crescente na lista de espera (33%) e têm que esperar mais tempo para receber um transplante do que pacientes não sensibilizados. Aos 36 meses na lista de espera, 10% morreram antes de receber um transplante. Aqueles que recebem transplantes requerem dessensibilização. Os protocolos de dessensibilização atuais incluem anticorpo monoclonal anti-CD20 para remover células B, um inibidor de proteassoma para eliminar células plasmáticas e troca de plasma e/ou imunoglobulina intravenosa (IVIG) para remover anticorpos específicos do doador pré-formados (DSA). O sucesso desses protocolos pode ser medido usando a tecnologia luminex de grânulo de antígeno único (SAB). Esses protocolos de dessensibilização demonstraram diminuir significativamente a intensidade média de fluorescência (MFI). Os protocolos de dessensibilização normalmente são mais eficazes na remoção de anticorpos que reconhecem moléculas HLA Classe I do que aqueles que reconhecem moléculas HLA Classe II. Infelizmente, mesmo após o pré-condicionamento, os pacientes sensibilizados têm maior probabilidade de desenvolver rejeição mediada por anticorpos (ABMR) do que os pacientes que não possuem anticorpos específicos do doador antes do transplante. Atualmente, os níveis séricos de DSA são medidos após a dessensibilização, mas não as células B específicas do doador (DSB). É possível que células B e/ou células plasmáticas permaneçam após o tratamento. Células B específicas do doador, após o transplante e a exposição concomitante ao antígeno, podem ser reestimuladas para produzir anticorpos e também para se desenvolver em células plasmáticas que produzem anticorpos. Portanto, um meio potencialmente melhor de determinar se a dessensibilização foi bem-sucedida seria examinar o nível de DSA usando a tecnologia SAB conforme descrito acima e examinar o DSB para determinar se essas células foram adequadamente eliminadas pelo protocolo de dessensibilização.

Objetivo Específico 1 Hipótese: Pacientes com depuração adequada de DSA sérico, mas que ainda apresentam populações significativas de DSB têm maior probabilidade de desenvolver ABMR.

No Objetivo Específico 1, os investigadores utilizarão tecnologia de ponta para observar os níveis de anticorpos anti-HLA, particularmente anticorpos específicos do doador, presentes em pacientes sensibilizados por coloração de DSB com tetrâmeros HLA classe I. Este método permite a enumeração e caracterização da origem do DSA, o DSB. Os investigadores determinarão o número de DSB e células plasmáticas específicas do doador (DSPC) antes e depois da dessensibilização, bem como posteriormente após o transplante. Além disso, os investigadores observarão o fenótipo e o estado de ativação do DSB antes e depois do transplante. Tetrâmeros de HLA classe I são moléculas de MHC de classe I de um determinado alelo que são redobradas com um peptídeo no sulco de ligação do peptídeo, biotiniladas na cauda do terminal C e tetramerizadas usando estreptavidina conjugada a um fluoróforo como a ficoeritrina (PE). Da mesma forma, os tetrâmeros HLA classe II são feitos de alelos MHC classe II. As células B retêm o anticorpo ligado à membrana que tem a especificidade exata dos anticorpos solúveis que também produz. Os tetrâmeros se ligarão apenas às células B que possuem anticorpos contra aquele alelo HLA classe I específico na superfície, uma vez que a ligação é determinada apenas pela especificidade do anticorpo. Ao mesmo tempo, as células serão coradas com outros marcadores para determinar o estado de ativação e o fenótipo do DSB. Este ensaio é feito usando citometria de fluxo. Além disso, os investigadores medirão os níveis de citocina BAFF e APRIL por Elisa em todos os momentos. Essas citocinas estão intimamente relacionadas ao desenvolvimento de células B. Há dados que sugerem que o BAFF é elevado após algumas formas de dessensibilização, o que poderia aumentar o desenvolvimento de novas células B.

Objetivo Específico 1 Hipótese: Pacientes com depuração adequada de DSA sérico, mas que ainda apresentam populações significativas de DSB têm maior probabilidade de desenvolver ABMR.

No Objetivo Específico 1, os investigadores utilizarão tecnologia de ponta para observar os níveis de anticorpos anti-HLA, particularmente anticorpos específicos do doador, presentes em pacientes sensibilizados por coloração de DSB com tetrâmeros HLA classe I. Este método permite a enumeração e caracterização da origem do DSA, o DSB. Os investigadores determinarão o número de DSB e células plasmáticas específicas do doador (DSPC) antes e depois da dessensibilização, bem como posteriormente após o transplante. Além disso, os investigadores observarão o fenótipo e o estado de ativação do DSB antes e depois do transplante. Tetrâmeros de HLA classe I são moléculas de MHC de classe I de um determinado alelo que são redobradas com um peptídeo no sulco de ligação do peptídeo, biotiniladas na cauda do terminal C e tetramerizadas usando estreptavidina conjugada a um fluoróforo como a ficoeritrina (PE). Da mesma forma, os tetrâmeros HLA classe II são feitos de alelos MHC classe II. As células B retêm o anticorpo ligado à membrana que tem a especificidade exata dos anticorpos solúveis que também produz. Os tetrâmeros se ligarão apenas às células B que possuem anticorpos contra aquele alelo HLA classe I específico na superfície, uma vez que a ligação é determinada apenas pela especificidade do anticorpo. Ao mesmo tempo, as células serão coradas com outros marcadores para determinar o estado de ativação e o fenótipo do DSB. Este ensaio é feito usando citometria de fluxo. Além disso, mediremos os níveis de citocinas BAFF e APRIL por Elisa em todos os momentos. Essas citocinas estão intimamente relacionadas ao desenvolvimento de células B. Há dados que sugerem que o BAFF é elevado após algumas formas de dessensibilização, o que poderia aumentar o desenvolvimento de novas células B.

Os investigadores obterão uma coleta de sangue dos indivíduos assim que o consentimento for obtido e utilizarão essa amostra para estabelecer uma linha de base de células B que produzem anticorpos que reconhecem tetrâmeros HLA classe I do mesmo tipo daqueles previamente identificados pela análise de anticorpos anti-HLA SAS. Imediatamente antes e depois de o paciente receber um transplante, a análise de anticorpos anti-HLA SAB, análise de tetrâmeros e BAFF/APRIL Elisas serão repetidas. As análises também serão realizadas entre 6 semanas e 2 meses após o transplante.

Objetivo Específico 2 Hipótese: Durante a rejeição crônica, os pacientes que respondem bem à dessensibilização e que são capazes de manter a tolerância após a dessensibilização terão menos DSB residual.

No Objetivo Específico 2, os investigadores utilizarão a mesma tecnologia para quantificar e caracterizar DSA e DSB quando um paciente apresentar rejeição crônica devido a ABMR. Nesse caso, o paciente pode não ter DSA quando transplantado, mas desenvolveu DSA de novo (dnDSA) após o transplante, causando rejeição. Ou o paciente pode ter tido DSA, ter sido dessensibilizado com sucesso, mantido a tolerância por um período de tempo e depois perdido a tolerância ou desenvolvido dnDSA. Os cronogramas serão semelhantes ao objetivo específico 1 - os investigadores coletarão amostras nos seguintes pontos de tempo: após o diagnóstico de ABMR, 1 semana após a dessensibilização e, em seguida, 2 a 3 meses após a dessensibilização para procurar rebote.

Além da inscrição de novos indivíduos, os investigadores também irão inscrever indivíduos normais saudáveis ​​para servir como controles.