Identification des cellules B spécifiques du donneur et rejet médié par les anticorps

Les patients sensibilisés, qui ont des anticorps réactifs au panel (PRA) > 20 %, constituent un groupe disproportionné et croissant sur la liste d'attente (33 %) et doivent attendre plus longtemps pour recevoir une greffe que les patients non sensibilisés. À 36 mois sur la liste d'attente, 10 % sont décédés avant d'avoir reçu une greffe. Ceux qui reçoivent des greffes nécessitent une désensibilisation. Les protocoles de désensibilisation actuels incluent un anticorps monoclonal anti-CD20 pour éliminer les lymphocytes B, un inhibiteur du protéasome pour éliminer les plasmocytes et l'échange plasmatique et/ou une immunoglobuline intraveineuse (IgIV) pour éliminer les anticorps préformés spécifiques au donneur (DSA). Le succès de ces protocoles peut être mesuré à l'aide de la technologie luminex de billes d'antigène unique (SAB). Il a été démontré que ces protocoles de désensibilisation diminuent considérablement l'intensité de fluorescence moyenne (MFI). Les protocoles de désensibilisation sont généralement plus efficaces pour éliminer les anticorps qui reconnaissent les molécules HLA de classe I que ceux qui reconnaissent les molécules HLA de classe II. Malheureusement, même après le préconditionnement, les patients sensibilisés sont plus susceptibles de développer un rejet médié par les anticorps (ABMR) que les patients qui n'ont pas d'anticorps spécifiques au donneur avant la greffe. Actuellement, les taux sériques de DSA sont mesurés après désensibilisation, mais pas les cellules B spécifiques du donneur (DSB). Il est possible que des lymphocytes B et/ou des plasmocytes restent après le traitement. Les lymphocytes B spécifiques du donneur, lors de la transplantation et de l'exposition concomitante à l'antigène, peuvent être restimulés pour à la fois produire des anticorps et également pour se développer en plasmocytes qui produisent des anticorps. Par conséquent, potentiellement un meilleur moyen de déterminer si la désensibilisation a réussi serait de regarder à la fois le niveau DSA en utilisant la technologie SAB comme décrit ci-dessus et de regarder DSB pour déterminer si ces cellules ont été correctement éliminées par le protocole de désensibilisation.

Hypothèse spécifique de l'objectif 1 : Les patients qui ont une clairance adéquate de la DSA sérique, mais qui ont encore des populations importantes de DSB sont plus susceptibles de développer un MRBA.

Dans l'objectif spécifique 1, les chercheurs utiliseront une technologie de pointe pour observer les niveaux d'anticorps anti-HLA, en particulier les anticorps spécifiques du donneur, présents chez les patients sensibilisés en colorant le DSB avec des tétramères HLA de classe I. Cette méthode permet l'énumération et la caractérisation de la source de DSA, le DSB. Les enquêteurs détermineront le nombre de DSB et de plasmocytes spécifiques du donneur (DSPC) avant et après la désensibilisation ainsi que plus tard après la greffe. De plus, les chercheurs examineront le phénotype et l'état d'activation de la DSB avant la greffe et après la greffe. Les tétramères HLA de classe I sont des molécules du CMH de classe I d'un allèle particulier qui sont repliées avec un peptide dans le sillon de liaison peptidique, biotinylées sur la queue C-terminale et tétramérisées à l'aide de streptavidine conjuguée à un fluorophore tel que la phycoérythrine (PE). De même, les tétramères HLA de classe II sont constitués d'allèles du CMH de classe II. Les lymphocytes B retiennent l'anticorps lié à la membrane qui a la spécificité exacte des anticorps solubles qu'il produit également. Les tétramères se lieront uniquement aux cellules B qui ont des anticorps contre cet allèle HLA de classe I spécifique à la surface, puisque la liaison est déterminée uniquement par la spécificité de l'anticorps. Dans le même temps, les cellules seront colorées avec d'autres marqueurs pour déterminer l'état d'activation et le phénotype du DSB. Ce dosage est réalisé par cytométrie en flux. De plus, les enquêteurs mesureront les niveaux de cytokines BAFF et APRIL par Elisa à tout moment. Ces cytokines sont étroitement liées au développement des cellules B. Il existe des données suggérant que le BAFF est élevé après certaines formes de désensibilisation, ce qui pourrait favoriser le développement de nouvelles cellules B.

Hypothèse spécifique de l'objectif 1 : Les patients qui ont une clairance adéquate de la DSA sérique, mais qui ont encore des populations importantes de DSB sont plus susceptibles de développer un MRBA.

Dans l'objectif spécifique 1, les chercheurs utiliseront une technologie de pointe pour observer les niveaux d'anticorps anti-HLA, en particulier les anticorps spécifiques du donneur, présents chez les patients sensibilisés en colorant le DSB avec des tétramères HLA de classe I. Cette méthode permet l'énumération et la caractérisation de la source de DSA, le DSB. Les enquêteurs détermineront le nombre de DSB et de plasmocytes spécifiques du donneur (DSPC) avant et après la désensibilisation ainsi que plus tard après la greffe. De plus, les chercheurs examineront le phénotype et l'état d'activation de la DSB avant la greffe et après la greffe. Les tétramères HLA de classe I sont des molécules du CMH de classe I d'un allèle particulier qui sont repliées avec un peptide dans le sillon de liaison peptidique, biotinylées sur la queue C-terminale et tétramérisées à l'aide de streptavidine conjuguée à un fluorophore tel que la phycoérythrine (PE). De même, les tétramères HLA de classe II sont constitués d'allèles du CMH de classe II. Les lymphocytes B retiennent l'anticorps lié à la membrane qui a la spécificité exacte des anticorps solubles qu'il produit également. Les tétramères se lieront uniquement aux cellules B qui ont des anticorps contre cet allèle HLA de classe I spécifique à la surface, puisque la liaison est déterminée uniquement par la spécificité de l'anticorps. Dans le même temps, les cellules seront colorées avec d'autres marqueurs pour déterminer l'état d'activation et le phénotype du DSB. Ce dosage est réalisé par cytométrie en flux. De plus, nous mesurerons les niveaux de cytokines BAFF et APRIL par Elisa à tout moment. Ces cytokines sont étroitement liées au développement des cellules B. Il existe des données suggérant que le BAFF est élevé après certaines formes de désensibilisation, ce qui pourrait favoriser le développement de nouvelles cellules B.

Les enquêteurs obtiendront une prise de sang des sujets une fois le consentement obtenu et utiliseront cet échantillon pour établir une base de cellules B qui produisent des anticorps qui reconnaissent les tétramères HLA de classe I du même type que ceux précédemment identifiés par l'analyse des anticorps SAS anti-HLA. Immédiatement avant et après que le patient reçoive une greffe, l'analyse des anticorps anti-HLA SAB, l'analyse des tétramères et les tests BAFF/APRIL Elisa seront répétés. Des analyses seront également effectuées entre 6 semaines et 2 mois après la greffe.

Spécifique Objectif 2 Hypothèse : Lors d'un rejet chronique, les patients qui répondent bien à la désensibilisation et qui sont capables de maintenir une tolérance après la désensibilisation auront moins de DSB résiduel.

Dans l'objectif spécifique 2, les chercheurs utiliseront la même technologie pour quantifier et caractériser le DSA et le DSB lorsqu'un patient subit un rejet chronique en raison d'un ABMR. Dans ce cas, le patient peut ne pas avoir eu de DSA lors de la transplantation, mais avoir développé une DSA de novo (dnDSA) après la transplantation, provoquant un rejet. Ou le patient peut avoir eu du DSA, avoir été désensibilisé avec succès, avoir maintenu sa tolérance pendant un certain temps, puis avoir perdu sa tolérance ou développé du dnDSA. Les délais seront similaires à l'objectif spécifique 1 - les enquêteurs prélèveront des échantillons aux moments suivants : lors du diagnostic d'ABMR, 1 semaine après la désensibilisation, puis 2 à 3 mois après la désensibilisation pour rechercher un rebond.

En plus du recrutement de nouveaux sujets, les enquêteurs recruteront également des individus normaux en bonne santé pour servir de témoins.