Identifizierung spenderspezifischer B-Zellen und Antikörper-vermittelte Abstoßung

Sensibilisierte Patienten mit Panel-reaktiven Antikörpern (PRAs) > 20 % bilden eine überproportionale und zunehmende Gruppe auf der Warteliste (33 %) und müssen länger auf eine Transplantation warten als nicht sensibilisierte Patienten. Nach 36 Monaten auf der Warteliste starben 10 %, bevor sie eine Transplantation erhielten. Diejenigen, die Transplantate erhalten, müssen desensibilisiert werden. Die aktuellen Desensibilisierungsprotokolle umfassen monoklonale Anti-CD20-Antikörper zur Entfernung von B-Zellen, einen Proteasom-Inhibitor zur Entfernung von Plasmazellen und Plasmaaustausch und/oder intravenöses Immunglobulin (IVIG) zur Entfernung vorgebildeter spenderspezifischer Antikörper (DSA). Der Erfolg dieser Protokolle kann mit der Single Antigen Bead (SAB) Luminex-Technologie gemessen werden. Es wurde gezeigt, dass diese Desensibilisierungsprotokolle die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) signifikant verringern. Desensibilisierungsprotokolle sind typischerweise wirksamer beim Entfernen von Antikörpern, die HLA-Klasse-I-Moleküle erkennen, als solche, die HLA-Klasse-II-Moleküle erkennen. Leider entwickeln sensibilisierte Patienten selbst nach einer Vorkonditionierung mit größerer Wahrscheinlichkeit eine antikörpervermittelte Abstoßung (ABMR) als Patienten, die vor der Transplantation keine spenderspezifischen Antikörper haben. Derzeit werden die Serumspiegel von DSA nach Desensibilisierung gemessen, aber nicht Spender-spezifische B-Zellen (DSB). Es ist möglich, dass B-Zellen und/oder Plasmazellen nach der Behandlung zurückbleiben. Spenderspezifische B-Zellen können nach der Transplantation und dem begleitenden Kontakt mit Antigen restimuliert werden, um sowohl Antikörper zu produzieren als auch sich zu Plasmazellen zu entwickeln, die Antikörper produzieren. Daher wäre es möglicherweise ein besseres Mittel, um festzustellen, ob die Desensibilisierung erfolgreich war, sowohl den DSA-Wert unter Verwendung der SAB-Technologie wie oben beschrieben als auch den DSB zu betrachten, um festzustellen, ob diese Zellen durch das Desensibilisierungsprotokoll ausreichend beseitigt wurden.

Spezifische Ziel-1-Hypothese: Patienten, die eine ausreichende Clearance von Serum-DSA haben, aber immer noch signifikante Populationen von DSB haben, entwickeln mit größerer Wahrscheinlichkeit ABMR.

Im Rahmen des spezifischen Ziels 1 werden die Forscher modernste Technologie einsetzen, um die Konzentrationen von Anti-HLA-Antikörpern, insbesondere spenderspezifischen Antikörpern, zu beobachten, die bei sensibilisierten Patienten vorhanden sind, indem sie DSB mit HLA-Klasse-I-Tetrameren färben. Dieses Verfahren ermöglicht die Aufzählung und Charakterisierung der DSA-Quelle, des DSB. Die Forscher bestimmen die Anzahl der DSB und spenderspezifischen Plasmazellen (DSPC) vor und nach der Desensibilisierung sowie später nach der Transplantation. Darüber hinaus werden die Ermittler den Phänotyp und den Aktivierungszustand des DSB vor der Transplantation und nach der Transplantation untersuchen. HLA-Klasse-I-Tetramere sind MHC-Klasse-I-Moleküle eines bestimmten Allels, die mit einem Peptid in der Peptidbindungsfurche neu gefaltet, am C-terminalen Schwanz biotinyliert und unter Verwendung von Streptavidin tetramerisiert werden, das mit einem Fluorophor wie Phycoerythrin (PE) konjugiert ist. In ähnlicher Weise bestehen HLA-Klasse-II-Tetramere aus MHC-Klasse-II-Allelen. B-Zellen behalten membrangebundenen Antikörper, der die genaue Spezifität der löslichen Antikörper hat, die sie auch produzieren. Die Tetramere binden nur an B-Zellen, die Antikörper gegen dieses spezifische HLA-Klasse-I-Allel auf der Oberfläche aufweisen, da die Bindung nur durch die Spezifität des Antikörpers bestimmt wird. Gleichzeitig werden die Zellen mit anderen Markern gefärbt, um den Aktivierungszustand und den Phänotyp des DSB zu bestimmen. Dieser Assay wird unter Verwendung von Durchflusszytometrie durchgeführt. Darüber hinaus werden die Ermittler die BAFF- und APRIL-Zytokinspiegel durch Elisa zu allen Zeitpunkten messen. Diese Zytokine sind eng mit der Entwicklung von B-Zellen verbunden. Es gibt Daten, die darauf hindeuten, dass BAFF nach einigen Formen der Desensibilisierung erhöht ist, was die Entwicklung neuer B-Zellen fördern könnte.

Spezifische Ziel-1-Hypothese: Patienten, die eine ausreichende Clearance von Serum-DSA haben, aber immer noch signifikante Populationen von DSB haben, entwickeln mit größerer Wahrscheinlichkeit ABMR.

Im Rahmen des spezifischen Ziels 1 werden die Forscher modernste Technologie einsetzen, um die Konzentrationen von Anti-HLA-Antikörpern, insbesondere spenderspezifischen Antikörpern, zu beobachten, die bei sensibilisierten Patienten vorhanden sind, indem sie DSB mit HLA-Klasse-I-Tetrameren färben. Dieses Verfahren ermöglicht die Aufzählung und Charakterisierung der DSA-Quelle, des DSB. Die Forscher bestimmen die Anzahl der DSB und spenderspezifischen Plasmazellen (DSPC) vor und nach der Desensibilisierung sowie später nach der Transplantation. Darüber hinaus werden die Ermittler den Phänotyp und den Aktivierungszustand des DSB vor der Transplantation und nach der Transplantation untersuchen. HLA-Klasse-I-Tetramere sind MHC-Klasse-I-Moleküle eines bestimmten Allels, die mit einem Peptid in der Peptidbindungsfurche neu gefaltet, am C-terminalen Schwanz biotinyliert und unter Verwendung von Streptavidin tetramerisiert werden, das mit einem Fluorophor wie Phycoerythrin (PE) konjugiert ist. In ähnlicher Weise bestehen HLA-Klasse-II-Tetramere aus MHC-Klasse-II-Allelen. B-Zellen behalten membrangebundenen Antikörper, der die genaue Spezifität der löslichen Antikörper hat, die sie auch produzieren. Die Tetramere binden nur an B-Zellen, die Antikörper gegen dieses spezifische HLA-Klasse-I-Allel auf der Oberfläche aufweisen, da die Bindung nur durch die Spezifität des Antikörpers bestimmt wird. Gleichzeitig werden die Zellen mit anderen Markern gefärbt, um den Aktivierungszustand und den Phänotyp des DSB zu bestimmen. Dieser Assay wird unter Verwendung von Durchflusszytometrie durchgeführt. Darüber hinaus werden wir zu allen Zeitpunkten die BAFF- und APRIL-Zytokinspiegel mit Elisa messen. Diese Zytokine sind eng mit der Entwicklung von B-Zellen verbunden. Es gibt Daten, die darauf hindeuten, dass BAFF nach einigen Formen der Desensibilisierung erhöht ist, was die Entwicklung neuer B-Zellen fördern könnte.

Die Ermittler werden den Probanden nach Einholung der Zustimmung eine Blutentnahme entnehmen und diese Probe verwenden, um eine Basislinie von B-Zellen zu ermitteln, die Antikörper produzieren, die HLA-Klasse-I-Tetramere desselben Typs erkennen, wie sie zuvor durch SAS-Anti-HLA-Antikörperanalyse identifiziert wurden. Unmittelbar vor und nach der Transplantation des Patienten werden die SAB-Anti-HLA-Antikörperanalyse, die Tetrameranalyse und die BAFF/APRIL-Elisas wiederholt. Analysen werden auch zwischen 6 Wochen und 2 Monaten nach der Transplantation durchgeführt.

Spezifische Ziel-2-Hypothese: Während der chronischen Abstoßung haben Patienten, die gut auf die Desensibilisierung ansprechen und die Toleranz nach der Desensibilisierung aufrechterhalten können, weniger Rest-DSB.

In Spezifisches Ziel 2 werden die Forscher dieselbe Technologie verwenden, um DSA und DSB zu quantifizieren und zu charakterisieren, wenn ein Patient aufgrund von ABMR eine chronische Abstoßung erleidet. In diesem Fall hatte der Patient bei der Transplantation möglicherweise kein DSA, entwickelte aber nach der Transplantation ein de novo DSA (dnDSA), was zu einer Abstoßung führte. Oder der Patient hatte DSA, wurde erfolgreich desensibilisiert, hielt die Toleranz für einen bestimmten Zeitraum aufrecht und verlor dann entweder die Toleranz oder entwickelte dnDSA. Die Fristen sind ähnlich wie bei spezifischem Ziel 1 – die Prüfärzte nehmen Proben zu folgenden Zeitpunkten: nach der Diagnose von ABMR, 1 Woche nach der Desensibilisierung, dann 2 bis 3 Monate nach der Desensibilisierung, um nach einem Rebound zu suchen.

Zusätzlich zur Einschreibung neuer Probanden werden die Ermittler auch gesunde, normale Personen einschreiben, die als Kontrollen dienen.