Identifiering av donatorspecifika B-celler och antikroppsmedierad avstötning

Patienter som är sensibiliserade, som har panelreaktiva antikroppar (PRA) > 20 %, utgör ett oproportionerligt och ökande kluster på väntelistan (33 %) och måste vänta längre på att få en transplantation än icke-sensibiliserade patienter. Efter 36 månader på väntelistan dog 10 % innan de fick en transplantation. De som får transplantationer kräver desensibilisering. De nuvarande desensibiliseringsprotokollen inkluderar anti-CD20 monoklonal antikropp för att avlägsna B-celler, en proteasominhibitor för att eliminera plasmaceller och plasmautbyte och/eller intravenöst immunglobulin (IVIG) för att avlägsna förbildade donatorspecifika antikroppar (DSA). Framgången för dessa protokoll kan mätas med luminexteknologi med enkel antigenpärla (SAB). Dessa desensibiliseringsprotokoll har visat sig signifikant minska den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI). Desensibiliseringsprotokoll är vanligtvis mer effektiva för att ta bort antikroppar som känner igen HLA Klass I-molekyler än de som känner igen HLA Klass II-molekyler. Tyvärr, även efter förkonditionering, är sensibiliserade patienter mer benägna att utveckla antikroppsmedierad avstötning (ABMR) än patienter som inte har donatorspecifika antikroppar före transplantationen. För närvarande mäts serumnivåer av DSA efter desensibilisering, men inte donatorspecifika B-celler (DSB). Det är möjligt att B-celler och/eller plasmaceller finns kvar efter behandling. Givarspecifika B-celler kan efter transplantation och åtföljande exponering för antigen stimuleras till att både producera antikroppar och även utvecklas till plasmaceller som producerar antikroppar. Därför skulle potentiellt ett bättre sätt att avgöra om desensibilisering har varit framgångsrik vara att titta på både DSA-nivån med användning av SAB-teknik enligt beskrivningen ovan och att titta på DSB för att avgöra om dessa celler har rensats tillräckligt av desensibiliseringsprotokollet.

Specifik mål 1-hypotes: Patienter som har adekvat clearance av serum-DSA, men som fortfarande har betydande populationer av DSB är mer benägna att utveckla ABMR.

I Specifikt mål 1 kommer utredarna att använda spetsteknologi för att observera nivåer av anti-HLA-antikroppar, särskilt donatorspecifika antikroppar, som finns hos sensibiliserade patienter genom att färga DSB med HLA klass I tetramerer. Denna metod tillåter uppräkning och karakterisering av källan till DSA, DSB. Utredarna kommer att fastställa antalet DSB och donatorspecifika plasmaceller (DSPC) före och efter desensibilisering samt senare efter transplantation. Dessutom kommer utredarna att titta på fenotyp och aktiveringstillstånd för DSB före transplantation och efter transplantation. HLA klass I-tetramerer är MHC klass I-molekyler av en viss allel som återveckas med en peptid i peptidbindningsspåret, biotinyleras på C-terminalsvansen och tetrameriseras med användning av streptavidin konjugerat till en fluorofor såsom fykoerytrin (PE). På liknande sätt är HLA klass II tetramerer gjorda av MHC klass II alleler. B-celler behåller membranbunden antikropp som har den exakta specificiteten av de lösliga antikropparna som den också producerar. Tetramererna kommer endast att binda till B-celler som har antikroppar mot den specifika HLA klass I-allelen på ytan, eftersom bindningen endast bestäms av antikroppens specificitet. Samtidigt kommer cellerna att färgas med andra markörer för att bestämma aktiveringstillståndet och fenotypen av DSB. Denna analys görs med hjälp av flödescytometri. Dessutom kommer utredarna att mäta BAFF- och APRIL-cytokinnivåerna av Elisa vid alla tidpunkter. Dessa cytokiner är nära besläktade med B-cellsutveckling. Det finns data som tyder på att BAFF är förhöjt efter vissa former av desensibilisering, vilket kan förbättra utvecklingen av nya B-celler.

Specifik mål 1-hypotes: Patienter som har adekvat clearance av serum-DSA, men som fortfarande har betydande populationer av DSB är mer benägna att utveckla ABMR.

I Specifikt mål 1 kommer utredarna att använda spetsteknologi för att observera nivåer av anti-HLA-antikroppar, särskilt donatorspecifika antikroppar, som finns hos sensibiliserade patienter genom att färga DSB med HLA klass I tetramerer. Denna metod tillåter uppräkning och karakterisering av källan till DSA, DSB. Utredarna kommer att fastställa antalet DSB och donatorspecifika plasmaceller (DSPC) före och efter desensibilisering samt senare efter transplantation. Dessutom kommer utredarna att titta på fenotyp och aktiveringstillstånd för DSB före transplantation och efter transplantation. HLA klass I-tetramerer är MHC klass I-molekyler av en viss allel som återveckas med en peptid i peptidbindningsspåret, biotinyleras på C-terminalsvansen och tetrameriseras med användning av streptavidin konjugerat till en fluorofor såsom fykoerytrin (PE). På liknande sätt är HLA klass II tetramerer gjorda av MHC klass II alleler. B-celler behåller membranbunden antikropp som har den exakta specificiteten av de lösliga antikropparna som den också producerar. Tetramererna kommer endast att binda till B-celler som har antikroppar mot den specifika HLA klass I-allelen på ytan, eftersom bindningen endast bestäms av antikroppens specificitet. Samtidigt kommer cellerna att färgas med andra markörer för att bestämma aktiveringstillståndet och fenotypen av DSB. Denna analys görs med hjälp av flödescytometri. Dessutom kommer vi att mäta BAFF och APRIL cytokinnivåer av Elisa vid alla tidpunkter. Dessa cytokiner är nära besläktade med B-cellsutveckling. Det finns data som tyder på att BAFF är förhöjt efter vissa former av desensibilisering, vilket kan förbättra utvecklingen av nya B-celler.

Utredarna kommer att ta ett blodprov från försökspersoner när samtycke har erhållits och använda detta prov för att fastställa en baslinje av B-celler som producerar antikroppar som känner igen HLA klass I tetramerer av samma typ som de som tidigare identifierats med SAS anti-HLA antikroppsanalys. Omedelbart före och efter att patienten får en transplantation kommer SAB anti-HLA antikroppsanalys, tetrameranalys och BAFF/APRIL Elisas att upprepas. Analyser kommer också att utföras mellan 6 veckor och 2 månader efter transplantationen.

Specifik Syfte 2 Hypotes: Under kronisk avstötning kommer patienter som svarar bra på desensibilisering och som kan bibehålla tolerans efter desensibilisering ha färre kvarvarande DSB.

I Specifikt mål 2 kommer utredarna att använda samma teknologi för att kvantifiera och karakterisera DSA och DSB när en patient upplever kronisk avstötning på grund av ABMR. I det här fallet kan patienten inte ha haft DSA vid transplantation, utan utvecklat de novo DSA (dnDSA) efter transplantationen, vilket orsakar avstötning. Eller så kan patienten ha haft DSA, blivit desensibiliserad framgångsrikt, bibehållit toleransen under en tid, sedan antingen tappat toleransen eller utvecklat dnDSA. Tidslinjerna kommer att likna specifikt mål 1 - utredarna kommer att ta prover vid följande tidpunkter: vid diagnos av ABMR, 1 vecka efter desensibilisering, sedan 2 till 3 månader efter desensibilisering för att leta efter rebound.

Utöver inskrivning av nya försökspersoner kommer utredarna också att registrera friska normala individer för att fungera som kontroller.