Identificazione di cellule B specifiche del donatore e rigetto mediato da anticorpi

I pazienti sensibilizzati, che hanno un pannello di anticorpi reattivi (PRA) > 20%, costituiscono un cluster sproporzionato e in aumento nella lista d'attesa (33%) e devono aspettare più a lungo per ricevere un trapianto rispetto ai pazienti non sensibilizzati. Entro 36 mesi in lista d'attesa, il 10% è morto prima di ricevere un trapianto. Coloro che ricevono trapianti richiedono desensibilizzazione. Gli attuali protocolli di desensibilizzazione includono l'anticorpo monoclonale anti-CD20 per rimuovere le cellule B, un inibitore del proteasoma per eliminare le plasmacellule e lo scambio plasmatico e/o l'immunoglobulina endovenosa (IVIG) per rimuovere gli anticorpi specifici del donatore (DSA) preformati. Il successo di questi protocolli può essere misurato utilizzando la tecnologia luminex a singolo antigene (SAB). È stato dimostrato che questi protocolli di desensibilizzazione riducono significativamente l'intensità media di fluorescenza (MFI). I protocolli di desensibilizzazione in genere sono più efficaci nella rimozione degli anticorpi che riconoscono le molecole HLA di classe I rispetto a quelli che riconoscono le molecole HLA di classe II. Sfortunatamente, anche dopo il pre-condizionamento, i pazienti sensibilizzati hanno maggiori probabilità di sviluppare rigetto mediato da anticorpi (ABMR) rispetto ai pazienti che non hanno anticorpi specifici del donatore prima del trapianto. Attualmente, i livelli sierici di DSA vengono misurati dopo la desensibilizzazione, ma non le cellule B specifiche del donatore (DSB). È possibile che le cellule B e/o le plasmacellule rimangano dopo il trattamento. Le cellule B specifiche del donatore, dopo il trapianto e la conseguente esposizione all'antigene, possono essere nuovamente stimolate sia per produrre anticorpi sia per svilupparsi in plasmacellule che producono anticorpi. Pertanto, potenzialmente un mezzo migliore per determinare se la desensibilizzazione ha avuto successo sarebbe esaminare sia il livello DSA utilizzando la tecnologia SAB come descritto sopra sia esaminare DSB per determinare se queste cellule sono state adeguatamente eliminate dal protocollo di desensibilizzazione.

Obiettivo specifico 1 Ipotesi: i pazienti che hanno un'adeguata clearance del DSA sierico, ma che hanno ancora popolazioni significative di DSB hanno maggiori probabilità di sviluppare ABMR.

Nell'obiettivo specifico 1, i ricercatori utilizzeranno una tecnologia all'avanguardia per osservare i livelli di anticorpi anti-HLA, in particolare anticorpi specifici del donatore, presenti in pazienti sensibilizzati colorando DSB con tetrameri HLA di classe I. Questo metodo consente l'enumerazione e la caratterizzazione della fonte di DSA, il DSB. Gli investigatori determineranno il numero di DSB e plasmacellule specifiche del donatore (DSPC) prima e dopo la desensibilizzazione e successivamente dopo il trapianto. Inoltre, gli investigatori esamineranno il fenotipo e lo stato di attivazione del DSB prima del trapianto e dopo il trapianto. I tetrameri HLA di classe I sono molecole MHC di classe I di un particolare allele che vengono ripiegate con un peptide nel solco di legame del peptide, biotinilate sulla coda terminale C e tetramerizzate usando streptavidina coniugata a un fluoroforo come la ficoeritrina (PE). Allo stesso modo, i tetrameri HLA di classe II sono costituiti da alleli MHC di classe II. Le cellule B trattengono l'anticorpo legato alla membrana che ha l'esatta specificità degli anticorpi solubili che produce anche. I tetrameri si legheranno solo alle cellule B che hanno anticorpi contro quello specifico allele HLA di classe I sulla superficie, poiché il legame è determinato solo dalla specificità dell'anticorpo. Allo stesso tempo, le cellule saranno colorate con altri marcatori per determinare lo stato di attivazione e il fenotipo del DSB. Questo test viene eseguito utilizzando la citometria a flusso. Inoltre, gli investigatori misureranno i livelli di citochine BAFF e APRIL di Elisa in tutti i momenti. Queste citochine sono strettamente correlate allo sviluppo delle cellule B. Ci sono dati che suggeriscono che il BAFF è elevato dopo alcune forme di desensibilizzazione, che potrebbero migliorare lo sviluppo di nuove cellule B.

Obiettivo specifico 1 Ipotesi: i pazienti che hanno un'adeguata clearance del DSA sierico, ma che hanno ancora popolazioni significative di DSB hanno maggiori probabilità di sviluppare ABMR.

Nell'obiettivo specifico 1, i ricercatori utilizzeranno una tecnologia all'avanguardia per osservare i livelli di anticorpi anti-HLA, in particolare anticorpi specifici del donatore, presenti in pazienti sensibilizzati colorando DSB con tetrameri HLA di classe I. Questo metodo consente l'enumerazione e la caratterizzazione della fonte di DSA, il DSB. Gli investigatori determineranno il numero di DSB e plasmacellule specifiche del donatore (DSPC) prima e dopo la desensibilizzazione e successivamente dopo il trapianto. Inoltre, gli investigatori esamineranno il fenotipo e lo stato di attivazione del DSB prima del trapianto e dopo il trapianto. I tetrameri HLA di classe I sono molecole MHC di classe I di un particolare allele che vengono ripiegate con un peptide nel solco di legame del peptide, biotinilate sulla coda terminale C e tetramerizzate usando streptavidina coniugata a un fluoroforo come la ficoeritrina (PE). Allo stesso modo, i tetrameri HLA di classe II sono costituiti da alleli MHC di classe II. Le cellule B trattengono l'anticorpo legato alla membrana che ha l'esatta specificità degli anticorpi solubili che produce anche. I tetrameri si legheranno solo alle cellule B che hanno anticorpi contro quello specifico allele HLA di classe I sulla superficie, poiché il legame è determinato solo dalla specificità dell'anticorpo. Allo stesso tempo, le cellule saranno colorate con altri marcatori per determinare lo stato di attivazione e il fenotipo del DSB. Questo test viene eseguito utilizzando la citometria a flusso. Inoltre, misureremo i livelli di citochine BAFF e APRIL mediante Elisa in tutti i momenti. Queste citochine sono strettamente correlate allo sviluppo delle cellule B. Ci sono dati che suggeriscono che il BAFF è elevato dopo alcune forme di desensibilizzazione, che potrebbero migliorare lo sviluppo di nuove cellule B.

Gli investigatori otterranno un prelievo di sangue dai soggetti una volta ottenuto il consenso e utilizzeranno questo campione per stabilire una linea di base di cellule B che producono anticorpi che riconoscono i tetrameri HLA di classe I dello stesso tipo di quelli precedentemente identificati dall'analisi degli anticorpi anti-HLA SAS. Immediatamente prima e dopo che il paziente riceve un trapianto, verranno ripetute l'analisi degli anticorpi anti-HLA SAB, l'analisi del tetramero e BAFF/APRIL Elisas. Le analisi verranno eseguite anche tra 6 settimane e 2 mesi dopo il trapianto.

Obiettivo specifico 2 Ipotesi: durante il rigetto cronico, i pazienti che rispondono bene alla desensibilizzazione e che sono in grado di mantenere la tolleranza dopo la desensibilizzazione avranno meno DSB residuo.

Nell'obiettivo specifico 2, i ricercatori utilizzeranno la stessa tecnologia per quantificare e caratterizzare DSA e DSB quando un paziente sperimenta un rigetto cronico dovuto ad ABMR. In questo caso, il paziente potrebbe non aver avuto DSA al momento del trapianto, ma ha sviluppato de novo DSA (dnDSA) dopo il trapianto, causando il rigetto. Oppure il paziente potrebbe aver avuto DSA, essere stato desensibilizzato con successo, aver mantenuto la tolleranza per un periodo di tempo, quindi aver perso la tolleranza o aver sviluppato dnDSA. Le tempistiche saranno simili all'obiettivo specifico 1: gli investigatori preleveranno campioni nei seguenti punti temporali: alla diagnosi di ABMR, 1 settimana dopo la desensibilizzazione, quindi da 2 a 3 mesi dopo la desensibilizzazione per cercare il rimbalzo.

Oltre all'arruolamento di nuovi soggetti, gli investigatori registreranno anche individui normali sani per fungere da controlli.