Luovuttajaspesifisten B-solujen tunnistaminen ja vasta-ainevälitteinen hylkiminen

Herkistyneet potilaat, joilla on paneelireaktiivisia vasta-aineita (PRA) > 20 %, muodostavat suhteettoman suuren ja kasvavan joukon jonotuslistalla (33 %) ja joutuvat odottamaan pidempään siirtoa kuin herkittämättömien potilaiden. 36 kuukauden odotuslistalla 10 % kuoli ennen elinsiirtoa. Ne, jotka saavat elinsiirtoja, tarvitsevat herkkyyttä. Nykyiset desensibilisaatioprotokollat ​​sisältävät monoklonaalisen anti-CD20-vasta-aineen B-solujen poistamiseksi, proteasomi-inhibiittorin plasmasolujen poistamiseksi ja plasmanvaihdon ja/tai suonensisäisen immunoglobuliinin (IVIG) ennalta muodostettujen luovuttajaspesifisten vasta-aineiden (DSA) poistamiseksi. Näiden protokollien menestystä voidaan mitata käyttämällä SAB (Single Antigen Bead) luminex-tekniikkaa. Näiden desensibilisaatiokäytäntöjen on osoitettu vähentävän merkittävästi keskimääräistä fluoresenssin intensiteettiä (MFI). Desensibilisaatioprotokollat ​​ovat tyypillisesti tehokkaampia poistamaan vasta-aineita, jotka tunnistavat HLA-luokan I-molekyylejä, kuin ne, jotka tunnistavat HLA-luokan II-molekyylejä. Valitettavasti jopa esihoidon jälkeen herkistyneille potilaille kehittyy todennäköisemmin vasta-ainevälitteinen hyljintäreaktio (ABMR) kuin potilaille, joilla ei ole luovuttajaspesifisiä vasta-aineita ennen elinsiirtoa. Tällä hetkellä DSA:n seerumitasot mitataan herkkyyden poistamisen jälkeen, mutta ei luovuttajaspesifisiä B-soluja (DSB). On mahdollista, että B-solut ja/tai plasmasolut jäävät jäljelle hoidon jälkeen. Luovuttajaspesifiset B-solut siirron ja siihen liittyvän antigeenialtistuksen jälkeen voidaan stimuloida uudelleen sekä tuottamaan vasta-ainetta että myös kehittymään plasmasoluiksi, jotka tuottavat vasta-ainetta. Siksi potentiaalisesti parempi tapa määrittää, onko herkkyyden poistaminen onnistunut, olisi tarkastella sekä DSA-tasoa käyttämällä SAB-tekniikkaa, kuten edellä on kuvattu, että tarkastella DSB:tä sen määrittämiseksi, onko nämä solut puhdistettu riittävästi herkkyysprotokollalla.

Erityistavoitteen 1 hypoteesi: Potilailla, joilla on riittävä seerumin DSA:n puhdistuma, mutta joilla on silti merkittävä DSB-populaatio, kehittyy todennäköisemmin ABMR.

Spesifisessä tavoitteessa 1 tutkijat käyttävät huipputeknologiaa tarkkaillakseen anti-HLA-vasta-aineiden, erityisesti luovuttajaspesifisten vasta-aineiden, tasoja herkistetyillä potilailla värjäämällä DSB:tä HLA-luokan I tetrameereillä. Tämä menetelmä mahdollistaa DSA:n lähteen, DSB:n, laskemisen ja karakterisoinnin. Tutkijat määrittävät DSB- ja luovuttajaspesifisten plasmasolujen (DSPC) lukumäärän ennen desensibilisaatiota ja sen jälkeen sekä myöhemmin siirron jälkeen. Lisäksi tutkijat tarkastelevat DSB:n fenotyyppiä ja aktivaatiotilaa ennen elinsiirtoa ja sen jälkeen. HLA-luokan I tetrameerit ovat tietyn alleelin MHC-luokan I molekyylejä, jotka laskostetaan uudelleen peptidin kanssa peptidiä sitovassa urassa, biotinyloidaan C-pään hännästä ja tetrameroidaan käyttämällä streptavidiinia, joka on konjugoitu fluoroforiin, kuten fykoerytriiniin (PE). Samoin HLA-luokan II tetrameerit valmistetaan MHC-luokan II alleeleista. B-solut säilyttävät kalvoon sitoutuneen vasta-aineen, jolla on täsmälleen sama spesifisyys kuin sen tuottamilla liukoisilla vasta-aineilla. Tetrameerit sitoutuvat vain B-soluihin, joiden pinnalla on vasta-aineita kyseistä spesifistä HLA-luokan I alleelia vastaan, koska sitoutumisen määrää vain vasta-aineen spesifisyys. Samaan aikaan solut värjätään muilla markkereilla DSB:n aktivaatiotilan ja fenotyypin määrittämiseksi. Tämä määritys tehdään käyttämällä virtaussytometriaa. Lisäksi tutkijat mittaavat Elisan BAFF- ja APRIL-sytokiinitasoja kaikkina aikoina. Nämä sytokiinit liittyvät läheisesti B-solujen kehitykseen. On olemassa tietoja, jotka viittaavat siihen, että BAFF on kohonnut joidenkin desensibilisaatiomuotojen jälkeen, mikä voisi edistää uusien B-solujen kehittymistä.

Erityistavoitteen 1 hypoteesi: Potilailla, joilla on riittävä seerumin DSA:n puhdistuma, mutta joilla on silti merkittävä DSB-populaatio, kehittyy todennäköisemmin ABMR.

Spesifisessä tavoitteessa 1 tutkijat käyttävät huipputeknologiaa tarkkaillakseen anti-HLA-vasta-aineiden, erityisesti luovuttajaspesifisten vasta-aineiden, tasoja herkistetyillä potilailla värjäämällä DSB:tä HLA-luokan I tetrameereillä. Tämä menetelmä mahdollistaa DSA:n lähteen, DSB:n, laskemisen ja karakterisoinnin. Tutkijat määrittävät DSB- ja luovuttajaspesifisten plasmasolujen (DSPC) lukumäärän ennen desensibilisaatiota ja sen jälkeen sekä myöhemmin siirron jälkeen. Lisäksi tutkijat tarkastelevat DSB:n fenotyyppiä ja aktivaatiotilaa ennen elinsiirtoa ja sen jälkeen. HLA-luokan I tetrameerit ovat tietyn alleelin MHC-luokan I molekyylejä, jotka laskostetaan uudelleen peptidin kanssa peptidiä sitovassa urassa, biotinyloidaan C-pään hännästä ja tetrameroidaan käyttämällä streptavidiinia, joka on konjugoitu fluoroforiin, kuten fykoerytriiniin (PE). Samoin HLA-luokan II tetrameerit valmistetaan MHC-luokan II alleeleista. B-solut säilyttävät kalvoon sitoutuneen vasta-aineen, jolla on täsmälleen sama spesifisyys kuin sen tuottamilla liukoisilla vasta-aineilla. Tetrameerit sitoutuvat vain B-soluihin, joiden pinnalla on vasta-aineita kyseistä spesifistä HLA-luokan I alleelia vastaan, koska sitoutumisen määrää vain vasta-aineen spesifisyys. Samaan aikaan solut värjätään muilla markkereilla DSB:n aktivaatiotilan ja fenotyypin määrittämiseksi. Tämä määritys tehdään käyttämällä virtaussytometriaa. Lisäksi Elisa mittaa BAFF- ja APRIL-sytokiinitasoja kaikkina aikoina. Nämä sytokiinit liittyvät läheisesti B-solujen kehitykseen. On olemassa tietoja, jotka viittaavat siihen, että BAFF on kohonnut joidenkin desensibilisaatiomuotojen jälkeen, mikä voisi edistää uusien B-solujen kehittymistä.

Tutkijat ottavat verikokeen koehenkilöiltä, ​​kun suostumus on saatu, ja käyttävät tätä näytettä perustaakseen B-soluja, jotka tuottavat vasta-aineita, jotka tunnistavat samantyyppisiä HLA-luokan I tetrameerejä kuin aiemmin SAS:n anti-HLA-vasta-aineanalyysillä tunnistetut. Välittömästi ennen ja jälkeen potilas saa elinsiirron, SAB anti-HLA -vasta-aineanalyysi, tetrameerianalyysi ja BAFF/APRIL Elisas toistetaan. Analyysit tehdään myös 6 viikon ja 2 kuukauden välillä elinsiirron jälkeen.

Erityistavoitteen 2 hypoteesi: Kroonisen hyljintäreaktion aikana potilailla, jotka reagoivat hyvin desensibilisaatioon ja jotka pystyvät säilyttämään sietokykynsä desensibilisoinnin jälkeen, on vähemmän DSB:tä.

Erityistavoitteessa 2 tutkijat käyttävät samaa tekniikkaa DSA:n ja DSB:n kvantifiointiin ja karakterisointiin, kun potilas kokee kroonisen hylkimisreaktion ABMR:n vuoksi. Tässä tapauksessa potilaalla ei ehkä ollut DSA:ta siirron aikana, mutta hänelle kehittyi de novo DSA (dnDSA) siirron jälkeen, mikä aiheutti hylkimisen. Tai potilaalla on voinut olla DSA, hänet on desensibilisoitu onnistuneesti, toleranssi on säilynyt jonkin aikaa, sitten joko menettänyt toleranssin tai kehittynyt dnDSA. Aikajanat ovat samanlaiset kuin erityistavoitteessa 1 – tutkijat ottavat näytteet seuraavina ajankohtina: ABMR-diagnoosin jälkeen, 1 viikko herkkyyden poistamisen jälkeen, sitten 2–3 kuukautta herkkyyden poistamisen jälkeen etsimään palautumista.

Uusien koehenkilöiden rekisteröinnin lisäksi tutkijat ottavat mukaan myös terveitä normaaleja yksilöitä toimimaan kontrolleina.