Identifikace dárcovských specifických B lymfocytů a protilátkami zprostředkované odmítnutí

Senzibilizovaní pacienti, kteří mají panel reaktivních protilátek (PRA) > 20 %, tvoří neúměrný a rostoucí shluk na čekací listině (33 %) a musí čekat na transplantaci déle než nesenzibilizovaní pacienti. Do 36 měsíců na čekací listině 10 % zemřelo před transplantací. Ti, kteří transplantaci dostanou, vyžadují desenzibilizaci. Současné desenzibilizační protokoly zahrnují anti-CD20 monoklonální protilátku k odstranění B buněk, inhibitor proteazomu k eliminaci plazmatických buněk a výměnu plazmy a/nebo intravenózní imunoglobulin (IVIG) k odstranění předem vytvořených dárcovských specifických protilátek (DSA). Úspěch těchto protokolů lze měřit pomocí technologie luminex s jedním antigenem (SAB). Ukázalo se, že tyto desenzibilizační protokoly významně snižují střední intenzitu fluorescence (MFI). Protokoly desenzibilizace jsou obvykle účinnější při odstraňování protilátek, které rozpoznávají molekuly HLA třídy I, než ty, které rozpoznávají molekuly HLA třídy II. Bohužel i po předběžné kondici je u senzibilizovaných pacientů pravděpodobnější, že dojde k rejekci zprostředkované protilátkou (ABMR), než u pacientů, kteří před transplantací nemají specifické protilátky dárce. V současné době se sérové ​​hladiny DSA měří po desenzibilizaci, ale ne dárcovské specifické B buňky (DSB). Je možné, že B buňky a/nebo plazmatické buňky zůstanou po léčbě. Dárcovské specifické B buňky po transplantaci a doprovodné expozici antigenu mohou být znovu stimulovány, aby produkovaly protilátku a také se vyvinuly v plazmatické buňky, které produkují protilátku. Potenciálně lepším prostředkem pro určení, zda byla desenzibilizace úspěšná, by tedy bylo podívat se jak na úroveň DSA pomocí technologie SAB, jak je popsáno výše, tak se podívat na DSB, aby se určilo, zda byly tyto buňky adekvátně vyčištěny protokolem desenzibilizace.

Specifický cíl 1 Hypotéza: U pacientů, kteří mají adekvátní clearance sérového DSA, ale stále mají významnou populaci DSB, je větší pravděpodobnost rozvoje ABMR.

Ve specifickém cíli 1 využijí výzkumníci špičkovou technologii k pozorování hladin anti-HLA protilátek, zejména dárcovských specifických protilátek, přítomných u senzibilizovaných pacientů barvením DSB tetramery HLA třídy I. Tato metoda umožňuje výčet a charakterizaci zdroje DSA, DSB. Vyšetřovatelé určí počet DSB a donorových specifických plazmatických buněk (DSPC) před a po desenzibilizaci, stejně jako později po transplantaci. Kromě toho se výzkumníci zaměří na fenotyp a stav aktivace DSB před transplantací a po transplantaci. Tetramery HLA I. třídy jsou molekuly MHC I. třídy konkrétní alely, které jsou znovu složeny s peptidem v drážce pro vazbu peptidu, biotinylovány na C-konci a tetramerizovány pomocí streptavidinu konjugovaného s fluoroforem, jako je fykoerythrin (PE). Podobně jsou tetramery HLA třídy II vyrobeny z alel MHC třídy II. B buňky si uchovávají membránu vázanou protilátku, která má přesnou specifitu jako rozpustné protilátky, které také produkuje. Tetramery se budou vázat pouze na B buňky, které mají na povrchu protilátky proti této specifické alele HLA třídy I, protože vazba je určena pouze specifitou protilátky. Současně budou buňky obarveny jinými markery, aby se určil stav aktivace a fenotyp DSB. Tento test se provádí pomocí průtokové cytometrie. Kromě toho budou výzkumníci měřit hladiny cytokinů BAFF a APRIL pomocí Elisa ve všech časových bodech. Tyto cytokiny úzce souvisejí s vývojem B buněk. Existují údaje, které naznačují, že BAFF je zvýšený po některých formách desenzibilizace, což by mohlo podpořit vývoj nových B buněk.

Specifický cíl 1 Hypotéza: U pacientů, kteří mají adekvátní clearance sérového DSA, ale stále mají významnou populaci DSB, je větší pravděpodobnost rozvoje ABMR.

Ve specifickém cíli 1 využijí výzkumníci špičkovou technologii k pozorování hladin anti-HLA protilátek, zejména dárcovských specifických protilátek, přítomných u senzibilizovaných pacientů barvením DSB tetramery HLA třídy I. Tato metoda umožňuje výčet a charakterizaci zdroje DSA, DSB. Vyšetřovatelé určí počet DSB a donorových specifických plazmatických buněk (DSPC) před a po desenzibilizaci, stejně jako později po transplantaci. Kromě toho se výzkumníci zaměří na fenotyp a stav aktivace DSB před transplantací a po transplantaci. Tetramery HLA I. třídy jsou molekuly MHC I. třídy konkrétní alely, které jsou znovu složeny s peptidem v drážce pro vazbu peptidu, biotinylovány na C-konci a tetramerizovány pomocí streptavidinu konjugovaného s fluoroforem, jako je fykoerythrin (PE). Podobně jsou tetramery HLA třídy II vyrobeny z alel MHC třídy II. B buňky si uchovávají membránu vázanou protilátku, která má přesnou specifitu jako rozpustné protilátky, které také produkuje. Tetramery se budou vázat pouze na B buňky, které mají na povrchu protilátky proti této specifické alele HLA třídy I, protože vazba je určena pouze specifitou protilátky. Současně budou buňky obarveny jinými markery, aby se určil stav aktivace a fenotyp DSB. Tento test se provádí pomocí průtokové cytometrie. Kromě toho budeme měřit hladiny cytokinů BAFF a APRIL pomocí Elisy ve všech časových bodech. Tyto cytokiny úzce souvisejí s vývojem B buněk. Existují údaje, které naznačují, že BAFF je zvýšený po některých formách desenzibilizace, což by mohlo podpořit vývoj nových B buněk.

Jakmile je získán souhlas, vyšetřovatelé získají od subjektů odběr krve a použijí tento vzorek k vytvoření základní linie B buněk, které produkují protilátky, které rozpoznávají tetramery HLA třídy I stejného typu jako ty, které byly dříve identifikovány analýzou SAS anti-HLA protilátek. Bezprostředně před a poté, co pacient obdrží transplantaci, bude opakována analýza SAB anti-HLA protilátek, analýza tetrameru a BAFF/APRIL Elisas. Analýzy budou také provedeny mezi 6 týdny a 2 měsíci po transplantaci.

Specifický cíl 2 Hypotéza: Během chronické rejekce budou mít pacienti, kteří dobře reagují na desenzibilizaci a kteří jsou schopni udržet toleranci po desenzibilizaci, méně reziduálního DSB.

Ve specifickém cíli 2 využijí výzkumníci stejnou technologii ke kvantifikaci a charakterizaci DSA a DSB, když pacient trpí chronickou rejekcí kvůli ABMR. V tomto případě pacient nemusel mít při transplantaci DSA, ale po transplantaci se u něj vyvinula de novo DSA (dnDSA), která způsobila odmítnutí. Nebo pacient mohl mít DSA, byl úspěšně desenzibilizován, udržoval si toleranci po určitou dobu, pak buď ztratil toleranci, nebo se u něj vyvinula dnDSA. Časové osy budou podobné specifickému cíli 1 – vyšetřovatelé odeberou vzorky v následujících časových bodech: po diagnóze ABMR, 1 týden po desenzibilizaci, poté 2 až 3 měsíce po desenzibilizaci, aby se hledal rebound fenomén.

Kromě zápisu nových subjektů výzkumníci také zapíší zdravé normální jedince, kteří budou sloužit jako kontroly.