Identificación de células B específicas del donante y rechazo mediado por anticuerpos

Los pacientes sensibilizados, que tienen anticuerpos reactivos del panel (PRA) > 20 %, constituyen un grupo desproporcionado y creciente en la lista de espera (33 %) y tienen que esperar más tiempo para recibir un trasplante que los pacientes no sensibilizados. A los 36 meses en lista de espera, el 10% fallecía antes de recibir un trasplante. Aquellos que reciben trasplantes requieren desensibilización. Los protocolos de desensibilización actuales incluyen anticuerpos monoclonales anti-CD20 para eliminar las células B, un inhibidor del proteasoma para eliminar las células plasmáticas y el intercambio de plasma y/o inmunoglobulina intravenosa (IVIG) para eliminar los anticuerpos específicos del donante (DSA) preformados. El éxito de estos protocolos se puede medir utilizando la tecnología luminex de perlas de antígeno único (SAB). Se ha demostrado que estos protocolos de desensibilización reducen significativamente la intensidad de fluorescencia media (MFI). Los protocolos de desensibilización suelen ser más eficaces para eliminar anticuerpos que reconocen moléculas HLA de clase I que aquellos que reconocen moléculas HLA de clase II. Desafortunadamente, incluso después del preacondicionamiento, los pacientes sensibilizados tienen más probabilidades de desarrollar un rechazo mediado por anticuerpos (ABMR) que los pacientes que no tienen anticuerpos específicos del donante antes del trasplante. Actualmente, los niveles séricos de DSA se miden después de la desensibilización, pero no las células B específicas del donante (DSB). Es posible que queden células B y/o células plasmáticas después del tratamiento. Las células B específicas del donante, tras el trasplante y la exposición concomitante al antígeno, pueden volver a estimularse para producir anticuerpos y también para convertirse en células plasmáticas que producen anticuerpos. Por lo tanto, potencialmente un mejor medio para determinar si la desensibilización ha tenido éxito sería observar tanto el nivel de DSA utilizando la tecnología SAB como se describió anteriormente como observar la DSB para determinar si estas células han sido eliminadas adecuadamente por el protocolo de desensibilización.

Hipótesis del objetivo específico 1: los pacientes que tienen una depuración adecuada de DSA en suero, pero que aún tienen poblaciones significativas de DSB tienen más probabilidades de desarrollar ABMR.

En el objetivo específico 1, los investigadores utilizarán tecnología de punta para observar los niveles de anticuerpos anti-HLA, en particular los anticuerpos específicos del donante, presentes en pacientes sensibilizados mediante la tinción de DSB con tetrámeros HLA de clase I. Este método permite la enumeración y caracterización de la fuente de DSA, el DSB. Los investigadores determinarán el número de DSB y células plasmáticas específicas del donante (DSPC) antes y después de la desensibilización, así como también después del trasplante. Además, los investigadores observarán el fenotipo y el estado de activación del DSB antes y después del trasplante. Los tetrámeros HLA clase I son moléculas MHC clase I de un alelo particular que se repliegan con un péptido en el surco de unión del péptido, se biotinilan en la cola terminal C y se tetramerizan usando estreptavidina conjugada con un fluoróforo como la ficoeritrina (PE). De manera similar, los tetrámeros HLA de clase II están hechos de alelos de MHC de clase II. Las células B retienen el anticuerpo unido a la membrana que tiene la especificidad exacta de los anticuerpos solubles que también produce. Los tetrámeros se unirán solo a las células B que tienen anticuerpos contra ese alelo HLA clase I específico en la superficie, ya que la unión está determinada solo por la especificidad del anticuerpo. Al mismo tiempo, las células se tiñerán con otros marcadores para determinar el estado de activación y el fenotipo del DSB. Este ensayo se realiza mediante citometría de flujo. Además, los investigadores medirán los niveles de citoquinas BAFF y APRIL mediante Elisa en todos los puntos de tiempo. Estas citocinas están estrechamente relacionadas con el desarrollo de células B. Hay datos que sugieren que BAFF se eleva después de algunas formas de desensibilización, lo que podría mejorar el desarrollo de nuevas células B.

Hipótesis del objetivo específico 1: los pacientes que tienen una depuración adecuada de DSA en suero, pero que aún tienen poblaciones significativas de DSB tienen más probabilidades de desarrollar ABMR.

En el objetivo específico 1, los investigadores utilizarán tecnología de punta para observar los niveles de anticuerpos anti-HLA, en particular los anticuerpos específicos del donante, presentes en pacientes sensibilizados mediante la tinción de DSB con tetrámeros HLA de clase I. Este método permite la enumeración y caracterización de la fuente de DSA, el DSB. Los investigadores determinarán el número de DSB y células plasmáticas específicas del donante (DSPC) antes y después de la desensibilización, así como también después del trasplante. Además, los investigadores observarán el fenotipo y el estado de activación del DSB antes y después del trasplante. Los tetrámeros HLA clase I son moléculas MHC clase I de un alelo particular que se repliegan con un péptido en el surco de unión del péptido, se biotinilan en la cola terminal C y se tetramerizan usando estreptavidina conjugada con un fluoróforo como la ficoeritrina (PE). De manera similar, los tetrámeros HLA de clase II están hechos de alelos de MHC de clase II. Las células B retienen el anticuerpo unido a la membrana que tiene la especificidad exacta de los anticuerpos solubles que también produce. Los tetrámeros se unirán solo a las células B que tienen anticuerpos contra ese alelo HLA clase I específico en la superficie, ya que la unión está determinada solo por la especificidad del anticuerpo. Al mismo tiempo, las células se tiñerán con otros marcadores para determinar el estado de activación y el fenotipo del DSB. Este ensayo se realiza mediante citometría de flujo. Además, mediremos los niveles de citocinas BAFF y APRIL mediante Elisa en todos los puntos de tiempo. Estas citocinas están estrechamente relacionadas con el desarrollo de células B. Hay datos que sugieren que BAFF se eleva después de algunas formas de desensibilización, lo que podría mejorar el desarrollo de nuevas células B.

Los investigadores obtendrán una extracción de sangre de los sujetos una vez que se obtenga el consentimiento y utilizarán esta muestra para establecer una línea de base de células B que produzcan anticuerpos que reconozcan tetrámeros HLA clase I del mismo tipo que los identificados previamente por el análisis de anticuerpos anti-HLA de SAS. Inmediatamente antes y después de que el paciente reciba un trasplante, se repetirán el análisis de anticuerpos SAB anti-HLA, el análisis de tetrámeros y BAFF/APRIL Elisas. También se realizarán análisis entre 6 semanas y 2 meses después del trasplante.

Hipótesis del objetivo específico 2: durante el rechazo crónico, los pacientes que responden bien a la desensibilización y que son capaces de mantener la tolerancia después de la desensibilización tendrán menos DSB residual.

En el objetivo específico 2, los investigadores utilizarán la misma tecnología para cuantificar y caracterizar DSA y DSB cuando un paciente experimente rechazo crónico debido a ABMR. En este caso, es posible que el paciente no haya tenido DSA cuando fue trasplantado, pero desarrolló DSA de novo (dnDSA) después del trasplante, lo que provocó el rechazo. O el paciente puede haber tenido DSA, haber sido desensibilizado con éxito, mantener la tolerancia durante un período de tiempo y luego perder la tolerancia o desarrollar dnDSA. Los plazos serán similares al objetivo específico 1: los investigadores tomarán muestras en los siguientes momentos: tras el diagnóstico de ABMR, 1 semana después de la desensibilización, luego de 2 a 3 meses después de la desensibilización para buscar un rebote.

Además de la inscripción de nuevos sujetos, los investigadores también inscribirán a individuos sanos y normales para que sirvan como controles.