Identificatie van donorspecifieke B-cellen en antilichaamgemedieerde afstoting

Patiënten die gesensibiliseerd zijn, die panelreactieve antilichamen (PRA's) > 20% hebben, vormen een onevenredig en toenemend cluster op de wachtlijst (33%) en moeten langer wachten op een transplantatie dan niet-gesensibiliseerde patiënten. Na 36 maanden op de wachtlijst stierf 10% voordat ze een transplantatie ontvingen. Degenen die wel transplantaties krijgen, hebben desensibilisatie nodig. De huidige desensibilisatieprotocollen omvatten anti-CD20 monoklonaal antilichaam om B-cellen te verwijderen, een proteasoomremmer om plasmacellen en plasma-uitwisseling te elimineren en/of intraveneus immunoglobuline (IVIG) om voorgevormde donorspecifieke antilichamen (DSA) te verwijderen. Het succes van deze protocollen kan worden gemeten met behulp van luminex-technologie met enkele antigeenparels (SAB). Van deze desensibilisatieprotocollen is aangetoond dat ze de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) significant verlagen. Desensibilisatieprotocollen zijn doorgaans effectiever in het verwijderen van antilichamen die HLA Klasse I-moleculen herkennen dan die welke HLA Klasse II-moleculen herkennen. Helaas hebben gesensibiliseerde patiënten, zelfs na preconditionering, meer kans op het ontwikkelen van antilichaamgemedieerde afstoting (ABMR) dan patiënten die vóór de transplantatie geen donorspecifieke antilichamen hebben. Momenteel worden serumspiegels van DSA gemeten na desensibilisatie, maar niet donorspecifieke B-cellen (DSB). Het is mogelijk dat er na de behandeling B-cellen en/of plasmacellen achterblijven. Donorspecifieke B-cellen kunnen na transplantatie en de bijbehorende blootstelling aan antigeen opnieuw worden gestimuleerd om zowel antilichaam te produceren als ook om zich te ontwikkelen tot plasmacellen die antilichaam produceren. Daarom zou een potentieel betere manier om te bepalen of desensibilisatie succesvol is geweest, zijn om zowel naar het DSA-niveau te kijken met behulp van SAB-technologie zoals hierboven beschreven als om naar DSB te kijken om te bepalen of deze cellen voldoende zijn geklaard door het desensibilisatieprotocol.

Specifieke doelstelling 1 Hypothese: Patiënten die voldoende klaring van serum DSA hebben, maar die nog steeds significante DSB-populaties hebben, hebben een grotere kans om ABMR te ontwikkelen.

In Specific Aim 1 zullen de onderzoekers geavanceerde technologie gebruiken om niveaus van anti-HLA-antilichamen, met name donorspecifieke antilichamen, aanwezig in gesensibiliseerde patiënten te observeren door DSB te kleuren met HLA klasse I-tetrameren. Deze methode maakt opsomming en karakterisering van de bron van DSA, de DSB, mogelijk. De onderzoekers bepalen het aantal DSB- en donorspecifieke plasmacellen (DSPC) vóór en na desensibilisatie en later na de transplantatie. Daarnaast zullen de onderzoekers kijken naar het fenotype en de activeringsstatus van de DSB voorafgaand aan transplantatie en na transplantatie. HLA klasse I-tetrameren zijn MHC klasse I-moleculen van een bepaald allel die opnieuw worden gevouwen met een peptide in de peptidebindingsgroef, gebiotinyleerd op de C-terminale staart en getetrameriseerd met behulp van streptavidine geconjugeerd aan een fluorofoor zoals fycoerythrine (PE). Evenzo zijn HLA klasse II-tetrameren gemaakt van MHC klasse II-allelen. B-cellen behouden membraangebonden antilichaam dat de exacte specificiteit heeft van de oplosbare antilichamen die het ook produceert. De tetrameren zullen alleen binden aan B-cellen die antilichamen tegen dat specifieke HLA klasse I-allel op het oppervlak hebben, aangezien de binding alleen wordt bepaald door de specificiteit van het antilichaam. Tegelijkertijd worden de cellen gekleurd met andere merkers om de activeringstoestand en het fenotype van de DSB te bepalen. Deze test wordt gedaan met behulp van flowcytometrie. Bovendien zullen de onderzoekers de cytokineniveaus van BAFF en APRIL door Elisa op alle tijdstippen meten. Deze cytokinen zijn nauw verwant aan de ontwikkeling van B-cellen. Er zijn gegevens die suggereren dat BAFF verhoogd is na sommige vormen van desensibilisatie, wat de ontwikkeling van nieuwe B-cellen zou kunnen bevorderen.

Specifieke doelstelling 1 Hypothese: Patiënten die voldoende klaring van serum DSA hebben, maar die nog steeds significante DSB-populaties hebben, hebben een grotere kans om ABMR te ontwikkelen.

In Specific Aim 1 zullen de onderzoekers geavanceerde technologie gebruiken om niveaus van anti-HLA-antilichamen, met name donorspecifieke antilichamen, aanwezig in gesensibiliseerde patiënten te observeren door DSB te kleuren met HLA klasse I-tetrameren. Deze methode maakt opsomming en karakterisering van de bron van DSA, de DSB, mogelijk. De onderzoekers bepalen het aantal DSB- en donorspecifieke plasmacellen (DSPC) vóór en na desensibilisatie en later na de transplantatie. Daarnaast zullen de onderzoekers kijken naar het fenotype en de activeringsstatus van de DSB voorafgaand aan transplantatie en na transplantatie. HLA klasse I-tetrameren zijn MHC klasse I-moleculen van een bepaald allel die opnieuw worden gevouwen met een peptide in de peptidebindingsgroef, gebiotinyleerd op de C-terminale staart en getetrameriseerd met behulp van streptavidine geconjugeerd aan een fluorofoor zoals fycoerythrine (PE). Evenzo zijn HLA klasse II-tetrameren gemaakt van MHC klasse II-allelen. B-cellen behouden membraangebonden antilichaam dat de exacte specificiteit heeft van de oplosbare antilichamen die het ook produceert. De tetrameren zullen alleen binden aan B-cellen die antilichamen tegen dat specifieke HLA klasse I-allel op het oppervlak hebben, aangezien de binding alleen wordt bepaald door de specificiteit van het antilichaam. Tegelijkertijd worden de cellen gekleurd met andere merkers om de activeringstoestand en het fenotype van de DSB te bepalen. Deze test wordt gedaan met behulp van flowcytometrie. Daarnaast zullen we BAFF- en APRIL-cytokineniveaus door Elisa op alle tijdstippen meten. Deze cytokinen zijn nauw verwant aan de ontwikkeling van B-cellen. Er zijn gegevens die suggereren dat BAFF verhoogd is na sommige vormen van desensibilisatie, wat de ontwikkeling van nieuwe B-cellen zou kunnen bevorderen.

De onderzoekers zullen een bloedafname van proefpersonen verkrijgen zodra toestemming is verkregen en dit monster gebruiken om een ​​basislijn vast te stellen van B-cellen die antilichamen produceren die HLA klasse I-tetrameren herkennen van hetzelfde type als eerder geïdentificeerd door SAS-anti-HLA-antilichaamanalyse. Onmiddellijk voor en nadat de patiënt een transplantatie heeft ondergaan, worden de SAB-anti-HLA-antilichaamanalyse, tetrameeranalyse en BAFF/APRIL-elisa's herhaald. Tussen 6 weken en 2 maanden na transplantatie worden ook analyses uitgevoerd.

Specifieke doelstelling 2 Hypothese: Tijdens chronische afstoting zullen patiënten die goed reageren op desensibilisatie en die in staat zijn om tolerantie te behouden na desensibilisatie, minder DSB-resten hebben.

In Specific Aim 2 zullen de onderzoekers dezelfde technologie gebruiken om DSA en DSB te kwantificeren en te karakteriseren wanneer een patiënt chronische afstoting als gevolg van ABMR ervaart. In dit geval heeft de patiënt mogelijk geen DSA gehad toen hij werd getransplanteerd, maar ontwikkelde hij de novo DSA (dnDSA) na de transplantatie, wat afstoting veroorzaakte. Het kan ook zijn dat de patiënt DSA heeft gehad, met succes is ongevoelig gemaakt, gedurende een bepaalde periode tolerantie heeft behouden, vervolgens de tolerantie heeft verloren of dnDSA heeft ontwikkeld. De tijdlijnen zullen vergelijkbaar zijn met specifiek doel 1 - de onderzoekers nemen monsters op de volgende tijdstippen: na diagnose van ABMR, 1 week na desensibilisatie, vervolgens 2 tot 3 maanden na desensibilisatie om te zoeken naar rebound.

Naast de inschrijving van nieuwe proefpersonen, zullen de onderzoekers ook gezonde, normale personen inschrijven om als controles te dienen.