非手术牙周治疗与口腔卫生指导对慢性牙周炎患者的影响

患有中度至晚期慢性牙周炎的受试者被选择用于这项纵向随机临床试验。 马来亚大学牙科学院医学伦理委员会批准了该研究的伦理审查 [医学伦理委员会编号：DF PE1002/0045(P)]。 该研究是根据 2000 年修订的 1975 年赫尔辛基宣言进行的。 遵循临床试验的 CONSORT 指南。

在 112 名筛选患者中，56 名患者符合纳入和排除标准。 纳入标准是至少有 12 颗牙齿有 5 毫米或更多的口袋，并且在至少 2 个不同的象限中探测附着损失 4 毫米或更多，这些象限在探诊时出血。 排除标准包括心血管病史、怀孕、吸烟者以及在过去 4 个月内接受抗生素治疗或在过去 6 个月内接受 NSPT 治疗的受试者。 招募的患者在马来亚大学牙科学院的牙周病诊所接受治疗。 使用 Cohen 的 d 公式计算出每个治疗组至少需要 26 名患者才能以 80% 的功效检测到这种差异。

在基线检查之前，患者使用块随机化分配到 NSPT 和 OHI 组。 NSPT 组患者接受 OHI、洗牙和根面平整，然后使用 0.12% 洗必太漱口水，而 OHI 组患者仅接受 OHI。 在每个月的召回访问中，两组参与者都会受到审查和激励。 只有 NSPT 组接受了专业预​​防。 两名经过校准的检查员（RPCR 和 WNAWA）对患者进行了所有治疗。 在基线和治疗后 3 个月，对除第三磨牙外的所有现有牙齿测定探诊深度 (PPD)、探诊附着缺失 (PAL)、牙龈出血指数 (BI) 和可见菌斑指数 (PI)。 对于 PI 和 BI，测量了 4 个位点（近中、远中、颊侧、舌侧），对于 PPD 和 PAL 记录了 6 个位点（远颊、中颊、近颊、近中舌、中舌和远侧）语言）。 利用 Kappa 统计，所有记录的临床参数的内部和内部操作员再现性获得了良好的协议 (>0.8)。

使用定量聚合酶链反应技术鉴定龈下微生物群。

在基线和治疗后 3 个月使用无菌刮匙从每个象限的最深部位采集牙龈下牙菌斑刮取样本，并将每个受试者的样本汇集在一起​​。 取样前，用棉卷保持隔离，并用棉球去除牙龈上的牙菌斑。 将斑块碎片重新悬浮在 1.5 ml 磷酸盐缓冲盐水中，并在提取 DNA 之前储存在 -80⁰C 冰箱中。 使用 Qiacube 机器（Qiagen®, Biotechnology, Netherlands）在实验室中使用 100µl 噬菌斑样品进行自动 DNA 提取。 在台式离心机上以 5,000 × g 的速度将含有斑块样品的试管离心 10 分钟以获得沉淀。 然后将沉淀用于 Qiacube 机器的自动 DNA 提取。 将 100µl 洗脱的 DNA 储存在 -20⁰C 中，用于使用定量聚合酶链反应（Applied Biosystem，美国）进行细菌检测。

本研究中使用的参考细菌菌株是 P.gingivalis (W83)、A.actinomycetemcomitans (NCTC9710)、P.intermedia (ATCC25611) 和 T.forsythia (CCUG 21028AT)。 所有细菌菌株均按照美国典型培养物保藏中心 (ATCC) 的推荐进行培养。 在细菌生长到指数晚期后，用无菌蒸馏水清洗它们，并使用与噬菌斑样品相同的方案进行 DNA 提取。

使用分光光度计（Nanodrop 2000，Thermo scientific，USA）测定提取的 DNA 的浓度和纯度。 相应地计算并记录来自噬菌斑样品和参考菌株的 DNA 浓度。 提取的 DNA 储存在 -20⁰C 中，直到定量聚合酶链反应程序开始。

按照 Boutaga 等人 (2005) 给出的方案进行定量聚合酶链反应。 为本研究选择的引物和探针如表 1 所示。 20ul 的总反应混合物用于扩增，其中包含 2ul 来自斑块样品/参考菌株的模板 DNA，10ul 的 2 x TaqMan 快速高级预混液（Applied biosystems，美国），1ul 的 20x 基因表达测定和 7ul 核酸酶免费水。 将除DNA样品外的反应混合物的所有组分加入1.5ml微量离心管中。 将管涡旋然后离心以除去气泡。 将混合物转移至加入 2ul DNA 样品的 96 孔板。 然后用光学粘合剂覆盖该板并再次离心以确保消除气泡。 使用的循环条件如下：50oc 2 分钟和 95oc 10 分钟，然后在 95oc 15 秒和 60oc 1 分钟下进行 45 个循环。

已知量的 DNA 参考菌株的稀释液用于生成具有相关系数 (R2: 0.99) 的标准曲线。 对于定量/拷贝数测定，未知样品的结果使用以下公式投影到从纯培养物获得的标准曲线上：数量 DNA = 10（ct-b）/ m。

血清中 Interleukin-1、Interleukin-6、脂联素和肿瘤坏死因子-α 水平的测定。

所有试剂在使用前都允许达到室温，并在实验前轻轻混合。 确定了测定所需的 8 孔板的数量。 将 100 ul 标准稀释缓冲液添加到零孔中，保留 1 孔用于色原空白。 将 100 ul 标准品、样品和对照品加入适当的微量滴定孔中。 将 50 ul 生物素化抗白细胞介素 6（生物素缀合物）溶液移入每个孔中，除了发色原空白，然后轻轻敲打板的侧面进行混合。 接下来，用板盖覆盖板并在室温下孵育2小时。 从孔中彻底吸出溶液并丢弃液体。 洗孔 4 次。 除色原空白外，每孔加入 100 ul 富含链霉亲和素-组氨酸的蛋白质工作溶液。 再次，将板用板盖覆盖并在室温下孵育30分钟。 孔中的溶液被彻底吸出并丢弃液体。 洗孔 4 次。 向每个孔中加入 100ul 稳定的色原。 将板在室温下在黑暗中孵育30分钟。 向每个孔中加入 100 ul 终止溶液，然后轻轻拍打板的侧面进行混合。 每个孔的吸光度在 450 nm 处读取，其中空白读板器针对由各 100 ul 稳定的色原和终止溶液组成的色原空白。 然后将标准品的吸光度相对于标准品浓度绘制在方格纸上。