Wirkung der nicht-chirurgischen Parodontaltherapie im Vergleich zu Anweisungen zur Mundhygiene bei Patienten mit chronischer Parodontitis

Für diese randomisierte klinische Längsschnittstudie wurden Probanden mit mittelschwerer bis fortgeschrittener chronischer Parodontitis ausgewählt. Die ethische Genehmigung für die Studie wurde von der Medizinischen Ethikkommission der Fakultät für Zahnmedizin der Universität Malaya erteilt [Nummer der Medizinischen Ethikkommission: DF PE1002/0045(P)]. Die Studie wurde im Einklang mit der Helsinki-Erklärung von 1975, überarbeitet im Jahr 2000, durchgeführt. Die CONSORT-Richtlinien für klinische Studien wurden befolgt.

Von den 112 untersuchten Patienten erfüllten 56 die Einschluss- und Ausschlusskriterien. Einschlusskriterien waren mindestens 12 vorhandene Zähne mit einer Tasche von 5 mm oder mehr und einem Sondierungs-Attachmentverlust von 4 mm oder mehr in mindestens 2 verschiedenen Quadranten, die bei der Sondierung bluteten. Zu den Ausschlusskriterien gehörten kardiovaskuläre Probleme in der Vorgeschichte, Schwangerschaft, Raucher und Personen, die in den letzten 4 Monaten Antibiotika oder in den letzten 6 Monaten NSPT erhielten. Rekrutierte Patienten wurden in der Klinik für Parodontologie der Fakultät für Zahnmedizin der Universität Malaya behandelt. Mithilfe der d-Formel von Cohen wurde berechnet, dass mindestens 26 Patienten pro Behandlungsgruppe erforderlich wären, um diesen Unterschied mit 80-prozentiger Aussagekraft zu erkennen.

Vor der Basisuntersuchung wurden die Patienten mittels Block-Randomisierung in die NSPT- und OHI-Gruppe eingeteilt. Patienten in der NSPT-Gruppe erhielten OHI, Zahnsteinentfernung und Wurzelglättung, gefolgt von Mundspülungen mit 0,12 % Chlorhexidin, während Patienten in der OHI-Gruppe nur OHI erhielten. Bei jedem monatlichen Rückrufbesuch wurden die Teilnehmer beider Gruppen überprüft und motiviert. Eine professionelle Prophylaxe erhielt nur die NSPT-Gruppe. Zwei kalibrierte Prüfer (RPCR und WNAWA) führten die gesamte Behandlung der Patienten durch. Die Sondierungstaschentiefe (PPD), der Sondierungsattackenverlust (PAL), der Gingivablutungsindex (BI) und der sichtbare Plaqueindex (PI) wurden an allen vorhandenen Zähnen mit Ausnahme der dritten Molaren zu Studienbeginn und 3 Monate nach der Therapie bestimmt. Für PI und BI wurden 4 Stellen gemessen (mesial, distal, bukkal, lingual) und für PPD und PAL wurden 6 Stellen aufgezeichnet (disto-bukkal, mittelbukkal, mesio-bukkal, mesio-lingual, mittellingual und disto-bukkal). lingual). Mithilfe der Kappa-Statistik wurden gute Übereinstimmungen (>0,8) für die Reproduzierbarkeit aller aufgezeichneten klinischen Parameter innerhalb und zwischen Bedienern erzielt.

Identifizierung subgingivaler Mikrobiota mithilfe der quantitativen Polymerase-Kettenreaktionstechnik.

Zu Beginn und drei Monate nach der Therapie wurden mit sterilen Küretten an den tiefsten Stellen jedes Quadranten Proben von subgingivalem Plaque entnommen und für jeden Probanden gepoolt. Vor der Probenahme wurde die Isolierung mit Watterollen aufrechterhalten und supragingivale Plaque mit Wattepellets entfernt. Plaqueabschabungen wurden in 1,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und vor der DNA-Extraktion bei -80 °C im Gefrierschrank gelagert. 100 µl Plaqueprobe wurden für die automatisierte DNA-Extraktion im Labor mit der Qiacube-Maschine (Qiagen®, Biotechnology, Niederlande) verwendet. Die Röhrchen mit den Plaqueproben wurden 10 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 5.000 × g auf einer Tischzentrifuge zentrifugiert, um das Pellet zu erhalten. Das Pellet wurde dann für die automatisierte DNA-Extraktion mit der Qiacube-Maschine verwendet. 100 µl eluierte DNA wurden bei -20 °C für den Bakteriennachweis mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (Applied Biosystem, USA) gelagert.

Die in dieser Studie verwendeten Referenzbakterienstämme waren P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) und T.forsythia (CCUG 21028AT). Alle Bakterienstämme wurden gemäß den Empfehlungen der American Type Culture Collection (ATCC) gezüchtet. Nach dem Wachstum der Bakterien bis zur späten exponentiellen Phase wurden sie mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen und die DNA-Extraktion wurde nach dem gleichen Protokoll wie für Plaque-Proben durchgeführt.

Die Konzentration und Reinheit der extrahierten DNA wurde mit einem Spektrophotometergerät (Nanodrop 2000, Thermo Scientific, USA) bestimmt. Die DNA-Konzentration sowohl der Plaque-Proben als auch des Referenzstamms wurde berechnet und entsprechend aufgezeichnet. Die extrahierten DNAs wurden bis zum Beginn des quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens bei -20 °C gelagert.

Für die quantitative Polymerasekettenreaktion wurde das Protokoll von Boutaga et al. (2005) befolgt. Die für diese Studie ausgewählten Primer und Sonden sind in Tabelle 1 aufgeführt. Für die Amplifikation wurde eine Gesamtreaktionsmischung von 20 µl verwendet, die 2 µl Matrizen-DNA aus Plaque-Probe/Referenzstamm, 10 µl 2 x TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, USA), 1 µl 20x Genexpressionsassay und 7 µl Nuklease enthält kostenloses Wasser. Alle Komponenten der Reaktionsmischung mit Ausnahme der DNA-Probe wurden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde gevortext und dann zentrifugiert, um Luftblasen zu entfernen. Die Mischung wurde unter Zugabe von 2 μl DNA-Probe auf eine Platte mit 96 Vertiefungen übertragen. Anschließend wurde die Platte mit optischem Klebstoff bedeckt und erneut zentrifugiert, um sicherzustellen, dass Luftblasen entfernt wurden. Die verwendeten Zyklusbedingungen waren wie folgt: 50 °C für 2 Minuten und 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und 60 °C für 1 Minute.

Verdünnungen bekannter Mengen an Referenz-DNA-Stämmen wurden verwendet, um Standardkurven mit Korrelationskoeffizienten (R2: 0,99) zu erstellen. Zur Quantifizierung/Kopienzahlbestimmung wurden die Ergebnisse unbekannter Proben auf die aus den Reinkulturen erhaltenen Standardkurven unter Verwendung der Formel projiziert: Menge DNA=10(ct-b)/m.

Bestimmung des Interleukin-1-, Interleukin-6-, Adiponektin- und Tumornekrosefaktor-Alpha-Spiegels im Serum.

Alle Reagenzien durften vor der Verwendung Raumtemperatur erreichen und wurden vor den Experimenten vorsichtig gemischt. Es wurde die Anzahl der für den Test benötigten 8-Well-Streifen bestimmt. 100 µl des Standard-Verdünnungspuffers wurden in Null-Wells gegeben und 1 Well wurde für den Chromogen-Blindwert reserviert. 100 µl Standards, Proben und Kontrollen wurden in die entsprechenden Mikrotitervertiefungen gegeben. 50 µl biotinylierte Anti-Interleukin-6-Lösung (Biotin-Konjugat) wurden in jede Vertiefung mit Ausnahme des Chromagen-Blindwerts pipettiert und dann zum Mischen vorsichtig auf die Seite der Platte geklopft. Anschließend wurden die Platten mit Plattenabdeckungen abgedeckt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden gründlich aus den Vertiefungen abgesaugt und die Flüssigkeit verworfen. Die Vertiefungen wurden viermal gewaschen. 100 μl Streptavidin-Histidin-reiche Protein-Arbeitslösung wurden zu jeder Vertiefung mit Ausnahme des Chromogen-Blindwerts gegeben. Auch hier wurden die Platten mit den Plattenabdeckungen abgedeckt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung aus den Vertiefungen wurde gründlich abgesaugt und die Flüssigkeit verworfen. Die Vertiefungen wurden viermal gewaschen. In jede Vertiefung wurden 100 µl stabilisiertes Chromogen gegeben. Die Platten wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. In jede Vertiefung wurden 100 µl Stopplösung gegeben und dann zum Mischen vorsichtig auf die Seite der Platte geklopft. Die Absorption jeder Vertiefung wurde bei 450 nm abgelesen, nachdem das Plattenlesegerät mit einem Chromogen-Blindwert, bestehend aus jeweils 100 µl stabilisiertem Chromogen und Stopplösung, abgeglichen wurde. Anschließend wurde die Extinktion der Standards gegenüber der Standardkonzentration auf Millimeterpapier aufgetragen.