A nem sebészeti periodontális terápia hatása: Szájhigiéniai utasítások a krónikus parodontózisban szenvedő betegekre

Ebbe a longitudinális randomizált klinikai vizsgálatba közepesen vagy előrehaladott krónikus parodontitiszben szenvedő alanyokat választottak ki. A vizsgálat etikai engedélyét a Malaya Egyetem Fogorvostudományi Karának Orvosi Etikai Bizottsága adta meg [Orvosetikai Bizottság száma: DF PE1002/0045(P)]. A vizsgálatot a 2000-ben felülvizsgált 1975-ös Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően végezték. A CONSORT klinikai vizsgálatokra vonatkozó irányelveit követték.

A 112 szűrt beteg közül 56 beteg teljesítette a beválasztási és kizárási kritériumokat. A felvételi kritériumok a következők voltak: legalább 12 fog jelenléte 5 mm-es vagy annál nagyobb zsebbel és legalább 4 mm-es tapadási veszteség legalább 2 különböző kvadránsban, amelyek a szondázáskor véreztek. A kizárási kritériumok közé tartozott az anamnézisben szereplő szív- és érrendszeri problémák, terhesség, dohányosok és az elmúlt 4 hónapban antibiotikumot vagy NSPT-t az elmúlt 6 hónapban kapott alanyok. A toborzott betegeket a Malaya Egyetem Fogorvostudományi Karának Parodontológiai Klinikáján kezelték. A Cohen-féle d képlet segítségével kiszámították, hogy kezelési csoportonként legalább 26 betegre lenne szükség ahhoz, hogy ezt a különbséget 80%-os teljesítménnyel észleljék.

A kiindulási vizsgálat előtt a betegeket az NSPT és az OHI csoportba sorolták be blokk randomizálással. Az NSPT csoport betegei OHI-t, hámlást és gyökérgyalulást, majd 0,12%-os klórhexidines szájöblítést kaptak, míg az OHI-csoportba tartozó betegek csak OHI-t kaptak. Minden havi felidéző ​​látogatás alkalmával mindkét csoport résztvevőit áttekintették és motiválták. Szakszerű profilaxisban csak az NSPT csoport részesült. Két kalibrált vizsgáló (RPCR és WNAWA) végzett minden kezelést a betegeken. A szondázó zsebmélységet (PPD), a tapintó tapadás elvesztését (PAL), a fogínyvérzési indexet (BI) és a látható plakk indexet (PI) minden jelen lévő fogon meghatároztuk, kivéve a harmadik őrlőfogakat a kiinduláskor és 3 hónappal a kezelés után. A PI és a BI esetében 4 helyet mértek (meziális, disztális, bukkális, linguális), a PPD és PAL esetében pedig 6 helyet (disto-bukkális, mid-bukkális, mesio-bukkális, mesio-linguális, középnyelvi és diszto- nyelvi). A Kappa statisztikát felhasználva jó megegyezéseket (>0,8) kaptunk az összes rögzített klinikai paraméter intra- és operátorok közötti reprodukálhatóságára vonatkozóan.

A szubgingivális mikrobióta azonosítása kvantitatív polimeráz láncreakciós technikával.

Az íny alatti plakk-kaparási mintákat a kiinduláskor és a terápia után 3 hónappal steril küretekkel vettük az egyes kvadránsok legmélyebb helyeiről, és minden egyes alanynál összegyűjtöttük. A mintavétel előtt az izolálást pamuttekercsekkel tartottuk fenn, és a szupragingivális lepedéket pamutpellettel távolítottuk el. A lepedékkapart 1,5 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban újraszuszpendáltuk, és -80 °C-on fagyasztószekrényben tároltuk a DNS-kivonás előtt. 100 µl plakkmintát használtunk a laboratóriumban végzett automatizált DNS-kivonáshoz a Qiacube gép (Qiagen®, Biotechnology, Hollandia) segítségével. A plakkmintákat tartalmazó csöveket 5000 × g sebességgel centrifugáltuk 10 percig asztali centrifugagépen, hogy megkapjuk a pelletet. A pelletet ezután a Qiacube géppel végzett automatizált DNS extrakcióhoz használták fel. 100 µl eluált DNS-t -20 °C-on tároltunk bakteriális kimutatáshoz kvantitatív polimeráz láncreakcióval (Applied Biosystem, USA).

A tanulmányban használt referencia baktériumtörzsek a P.gingivalis (W83), az A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), a P.intermedia (ATCC25611) és a T.forsythia (CCUG 21028AT) voltak. Valamennyi baktériumtörzset az American Type Culture Collection (ATCC) ajánlása szerint tenyésztettük. A baktériumok növekedése után a késői exponenciális fázisig steril desztillált vízzel mostuk, és a plakk mintákhoz hasonló protokoll szerint végeztük a DNS extrakciót.

Az extrahált DNS koncentrációját és tisztaságát spektrofotométerrel (Nanodrop 2000, Thermo science, USA) határoztuk meg. Mind a plakkmintákból, mind a referencia törzsből származó DNS-koncentrációt ennek megfelelően kiszámítottuk és rögzítettük. Az extrahált DNS-eket -20 °C-on tároltuk a kvantitatív polimeráz láncreakciós eljárás megkezdéséig.

Boutaga és munkatársai (2005) által megadott protokollt követték a kvantitatív polimeráz láncreakció esetében. A vizsgálathoz kiválasztott primereket és próbákat az 1. táblázat tartalmazza. Az amplifikációhoz 20 ul teljes reakcióelegyet használtunk, amely 2 ul plakkmintából/referenciatörzsből származó templát DNS-t, 10 ul 2 x TaqMan fast advanced master mixet (Applied biosystems, USA), 1 ul 20x génexpressziós vizsgálatot és 7 ul nukleázt tartalmaz. ingyenes víz. A reakcióelegy összes komponensét a DNS-minta kivételével 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe adtuk. A csövet vortexeljük, majd centrifugáljuk a légbuborékok eltávolítása érdekében. A keveréket 96 lyukú lemezre vittük 2 ul DNS-minta hozzáadásával. A lemezt ezután optikai ragasztóval fedtük be, és ismét centrifugáltuk, hogy megbizonyosodjunk a légbuborékok eltávolításáról. Az alkalmazott cikluskörülmények a következők voltak: 50 °C 2 percig és 95 °C 10 percig, majd 45 ciklus 95 °C-on 15 másodpercig és 60 °C-on 1 percig.

Ismert mennyiségű referencia DNS-törzs hígítását használtuk a korrelációs együtthatójú standard görbék létrehozására (R2: 0,99). A mennyiségi meghatározáshoz/másolatszám meghatározásához az ismeretlen mintákból származó eredményeket a tiszta tenyészetekből nyert standard görbékre vetítettük a következő képlettel: Mennyiség DNS=10(ct-b)/m.

Interleukin-1, Interleukin-6, Adiponektin és Tumor Necrosis Factor-alfa szint meghatározása a szérumban.

Használat előtt minden reagenst hagytunk szobahőmérsékletre melegedni, és óvatosan összekevertük a kísérletek előtt. Meghatároztuk a vizsgálathoz szükséges 8 lyukú csíkok számát. 100 ul standard hígítópuffert adtunk a nulla üregekhez, és 1 mérőhelyet fenntartottunk a kromogén vakpróba számára. 100 ul standardokat, mintákat és kontrollokat adtunk a megfelelő mikrotiter üregekbe. 50 ul biotinilezett anti-interleukin-6 (biotin konjugátum) oldatot pipettáztunk minden egyes lyukba, kivéve a kromagén vakpróbát, majd óvatosan megütögettük a lemez oldalát, hogy összekeverjük. Ezután a lemezeket lemezfedőkkel lefedtük, és 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az oldatokat alaposan leszívtuk a lyukakból, és a folyadékot elöntöttük. A kutakat négyszer mostuk. 100 ul sztreptavidin-hisztidinben gazdag fehérje munkaoldatot adtunk minden egyes mérőhelyhez, kivéve a kromogén vakpróbát. A lemezeket ismét lefedtük a lemezfedőkkel, és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az oldatot a lyukakból alaposan leszívtuk, és a folyadékot elöntöttük. A kutakat négyszer mostuk. 100 ul stabilizált kromogént adtunk minden egyes lyukba. A lemezeket 30 percig szobahőmérsékleten, sötétben inkubáltuk. 100 ul leállító oldatot adtunk minden egyes lyukba, majd óvatosan a lemez oldalára ütögettük, hogy összekeverjük. Az egyes üregek abszorbanciáját 450 nm-en olvastuk le, miután a lemezleolvasót 100 ul stabilizált kromogénből és stop oldatból álló kromogén vakpróbával szemben kezeltük. A standardok abszorbanciáját a standard koncentráció függvényében ezután milliméterpapíron ábrázoltuk.