Wpływ niechirurgicznej terapii periodontologicznej wersety instrukcji higieny jamy ustnej u pacjentów z przewlekłym zapaleniem przyzębia

Do tego podłużnego randomizowanego badania klinicznego wybrano osoby z umiarkowanym do zaawansowanego przewlekłym zapaleniem przyzębia. Zgoda etyczna dla badania została przyznana przez Komisję Etyki Lekarskiej Wydziału Stomatologii Uniwersytetu Malaya [numer Komisji Etyki Lekarskiej: DF PE1002/0045(P)]. Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską z 1975 r., zmienioną w 2000 r. Postępowano zgodnie z wytycznymi CONSORT dotyczącymi badań klinicznych.

Spośród 112 przebadanych pacjentów 56 spełniało kryteria włączenia i wyłączenia. Kryteria włączenia obejmowały co najmniej 12 zębów z kieszonką o średnicy co najmniej 5 mm i utratą przyczepu sondą co najmniej 4 mm w co najmniej 2 różnych kwadrantach, które krwawiły podczas sondowania. Kryteria wykluczenia obejmowały historię problemów sercowo-naczyniowych, ciążę, palacze i osoby otrzymujące antybiotyki w ciągu ostatnich 4 miesięcy lub NSPT w ciągu ostatnich 6 miesięcy. Zrekrutowani pacjenci byli leczeni w Klinice Periodontologii Wydziału Stomatologii Uniwersytetu Malaya. Stosując wzór d Cohena obliczono, że potrzeba co najmniej 26 pacjentów na grupę leczoną, aby wykryć tę różnicę z mocą 80%.

Przed badaniem wyjściowym pacjentów przydzielono do grupy NSPT i OHI za pomocą randomizacji blokowej. Pacjenci z grupy NSPT otrzymywali OHI, scaling i root planing, a następnie płukanki ust z 0,12% chlorheksydyną, podczas gdy pacjenci z grupy OHI otrzymywali tylko OHI. Podczas każdej comiesięcznej wizyty przypominającej uczestnicy obu grup byli oceniani i motywowani. Profesjonalną profilaktykę otrzymała jedynie grupa NSPT. Dwóch wykalibrowanych egzaminatorów (RPCR i WNAWA) wykonywało wszystkie zabiegi u pacjentów. Głębokość kieszonek dziąsłowych (PPD), utratę przyczepu dziąsłowego (PAL), wskaźnik krwawienia z dziąseł (BI) i wskaźnik widocznej płytki nazębnej (PI) określono na wszystkich obecnych zębach z wyjątkiem trzecich zębów trzonowych na początku leczenia i 3 miesiące po zakończeniu leczenia. Dla PI i BI zmierzono 4 miejsca (mezjalne, dystalne, policzkowe, językowe), a dla PPD i PAL 6 miejsc (dystopoliczkowe, środkowe policzkowe, mezjalno-policzkowe, mezjalno-językowe, środkowo-językowe i dysto- językowy). Wykorzystując statystyki Kappa, uzyskano dobrą zgodność (>0,8) dla wewnątrz- i międzyoperatorskiej odtwarzalności wszystkich zarejestrowanych parametrów klinicznych.

Identyfikacja mikroflory poddziąsłowej za pomocą techniki ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Próbki zeskrobin płytki nazębnej poddziąsłowej pobrano na początku leczenia i 3 miesiące po zakończeniu terapii sterylnymi kiretami z najgłębszych miejsc w każdym kwadrancie i zebrano razem dla każdego pacjenta. Przed pobraniem próbek izolację utrzymywano za pomocą wacików i usuwano płytkę nazębną naddziąsłową za pomocą wacików. Zeskrobane płytki nazębne ponownie zawieszono w 1,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i przechowywano w zamrażarce -80°C przed ekstrakcją DNA. 100 ul próbki łysinek użyto do zautomatyzowanej ekstrakcji DNA w laboratorium przy użyciu urządzenia Qiacube (Qiagen®, Biotechnology, Holandia). Probówki zawierające próbki płytek wirowano z prędkością 5000 x g przez 10 minut na wirówce stołowej w celu uzyskania osadu. Osad następnie wykorzystano do zautomatyzowanej ekstrakcji DNA za pomocą maszyny Qiacube. 100 µl eluowanego DNA przechowywano w temperaturze -20⁰C w celu wykrycia bakterii za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (Applied Biosystem, USA).

Referencyjne szczepy bakteryjne użyte w tym badaniu to P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) i T.forsythia (CCUG 21028AT). Wszystkie szczepy bakterii hodowano zgodnie z zaleceniami American Type Culture Collection (ATCC). Po wzroście bakterii do późnej fazy wykładniczej przepłukano je sterylną wodą destylowaną i przeprowadzono ekstrakcję DNA stosując ten sam protokół, co w przypadku próbek łysinek.

Stężenie i czystość wyekstrahowanego DNA określono za pomocą spektrofotometru (Nanodrop 2000, Thermo science, USA). Stężenie DNA z obu próbek łysinek i szczepu referencyjnego obliczono i odpowiednio zarejestrowano. Wyekstrahowane DNA przechowywano w temperaturze -20⁰C do momentu rozpoczęcia procedury ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Postępowano zgodnie z protokołem podanym przez Boutaga i in., (2005) dla ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy. Startery i sondy wybrane do tego badania przedstawiono w tabeli 1. Do amplifikacji użyto całkowitej mieszaniny reakcyjnej 20 ul, która zawiera 2 ul matrycy DNA z próbki łysinki/szczepu referencyjnego, 10 ul 2 x TaqMan fast advanced master mix (Applied Biosystems, USA), 1 ul testu ekspresji genów 20x i 7 ul nukleazy Darmowa woda. Wszystkie składniki mieszaniny reakcyjnej z wyjątkiem próbki DNA dodano do 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Probówkę worteksowano, a następnie odwirowano w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Mieszaninę przeniesiono do 96-dołkowej płytki z dodatkiem 2 ul próbki DNA. Płytkę następnie pokryto klejem optycznym i ponownie odwirowano, aby upewnić się, że pęcherzyki powietrza zostały wyeliminowane. Zastosowano następujące warunki cykli: 50°C przez 2 min i 95°C przez 10 min, a następnie 45 cykli w 95°C przez 15 s i 60°C przez 1 min.

Rozcieńczenia znanych ilości szczepów referencyjnych DNA wykorzystano do wygenerowania krzywych standardowych ze współczynnikiem korelacji (R2: 0,99). W celu oznaczenia ilościowego/liczby kopii, wyniki z nieznanych próbek rzutowano na krzywe wzorcowe otrzymane z czystych kultur przy użyciu wzoru: Ilość DNA=10(ct-b)/m.

Oznaczanie poziomu interleukiny-1, interleukiny-6, adiponektyny i czynnika martwicy nowotworu-alfa w surowicy.

Przed użyciem wszystkie odczynniki pozostawiono do osiągnięcia temperatury pokojowej i delikatnie wymieszano przed eksperymentami. Określono liczbę 8-dołkowych pasków potrzebnych do testu. Do studzienek zerowych dodano 100 ul standardowego buforu rozcieńczającego i 1 studzienkę zarezerwowano na ślepą próbę chromogenu. Do odpowiednich studzienek do mikromiareczkowania dodano 100 ul standardów, próbek i kontroli. 50 ul roztworu biotynylowanej anty-interleukiny-6 (koniugat biotyny) odpipetowano do każdej studzienki z wyjątkiem ślepej próby chromagenowej, a następnie delikatnie stuknięto w bok płytki w celu wymieszania. Następnie płytki przykryto pokrywkami i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwory dokładnie odessano ze studzienek i ciecz odrzucono. Studzienki przemyto 4 razy. Do każdej studzienki z wyjątkiem ślepej próby chromogenu dodano 100 μl roztworu roboczego białka bogatego w streptawidynę-histydynę. Ponownie płytki przykryto pokrywkami i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór ze studzienek dokładnie odessano i ciecz odrzucono. Studzienki przemyto 4 razy. Do każdej studzienki dodano 100 ul stabilizowanego chromogenu. Płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Do każdej studzienki dodano 100 μl roztworu zatrzymującego reakcję, a następnie delikatnie postukano w bok płytki w celu wymieszania. Absorbancję każdej studzienki odczytywano przy 450 nm po wyczyszczeniu czytnika płytek względem ślepej próby chromogenu złożonej z 100 µl stabilizowanego chromogenu i roztworu zatrzymującego reakcję. Absorbancję wzorców w stosunku do stężenia wzorca wykreślono następnie na papierze milimetrowym.