Efecto de la terapia periodontal no quirúrgica frente a las instrucciones de higiene oral en pacientes con periodontitis crónica

Se seleccionaron sujetos con periodontitis crónica de moderada a avanzada para este ensayo clínico aleatorizado longitudinal. La autorización ética para el estudio fue otorgada por el Comité de Ética Médica de la Facultad de Odontología de la Universidad de Malaya [Número del Comité de Ética Médica: DF PE1002/0045(P)]. El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki de 1975, revisada en 2000. Se siguieron las guías CONSORT para ensayos clínicos.

De los 112 pacientes examinados, 56 pacientes cumplieron los criterios de inclusión y exclusión. Los criterios de inclusión fueron un mínimo de 12 dientes presentes con bolsa de 5 mm o más y pérdida de inserción al sondaje de 4 mm o más en al menos 2 cuadrantes diferentes que sangraron al sondaje. Los criterios de exclusión incluyeron antecedentes de problemas cardiovasculares, embarazo, fumadores y sujetos que recibieron antibióticos en los últimos 4 meses o NSPT en los últimos 6 meses. Los pacientes reclutados fueron tratados en la clínica de Periodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad de Malaya. Utilizando la fórmula d de Cohen, se calculó que se necesitarían al menos 26 pacientes por grupo de tratamiento para detectar esta diferencia con una potencia del 80%.

Antes del examen inicial, los pacientes fueron asignados al grupo NSPT y OHI mediante aleatorización en bloques. Los pacientes del grupo NSPT recibieron OHI, raspado y alisado radicular seguidos de enjuagues bucales con clorhexidina al 0,12 %, mientras que los pacientes del grupo OHI recibieron solo OHI. En cada visita de recuerdo mensual, los participantes de ambos grupos fueron revisados ​​y motivados. La profilaxis profesional solo la recibió el grupo NSPT. Dos examinadores calibrados (RPCR y WNAWA) realizaron todo el tratamiento de los pacientes. Se determinaron la profundidad de la bolsa al sondaje (PPD), la pérdida de inserción al sondaje (PAL), el índice de sangrado gingival (BI) y el índice de placa visible (PI) en todos los dientes presentes excepto en los terceros molares al inicio del estudio y 3 meses después de la terapia. Para PI y BI se midieron 4 sitios (mesial, distal, bucal, lingual) y para PPD y PAL se registraron 6 sitios (distobucal, mediobucal, mesiobucal, mesiolingual, mediolingual y distobucal). lingual). Utilizando las estadísticas de Kappa, se obtuvieron buenas concordancias (>0,8) para la reproducibilidad intra e interoperador de todos los parámetros clínicos registrados.

Identificación de la microbiota subgingival mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.

Las muestras de raspado de placa subgingival se obtuvieron al inicio y 3 meses después de la terapia con curetas estériles de los sitios más profundos en cada cuadrante y se agruparon para cada sujeto. Antes de la toma de muestras, se mantuvo el aislamiento con rollos de algodón y se eliminó la placa supragingival con bolitas de algodón. Los raspados de placa se volvieron a suspender en 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato y se almacenaron en un congelador a -80 ⁰C antes de la extracción de ADN. Se usaron 100 µl de muestra de placa para la extracción automatizada de ADN en el laboratorio usando la máquina Qiacube (Qiagen®, Biotechnology, Países Bajos). Los tubos que contenían las muestras de placa se centrifugaron a una velocidad de 5000 × g durante 10 minutos en una máquina centrífuga de mesa para obtener el sedimento. Luego, el sedimento se usó para la extracción automática de ADN con la máquina Qiacube. Se almacenaron 100 μl de ADN eluido a -20 ⁰C para la detección bacteriana mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Applied Biosystem, EE. UU.).

Las cepas bacterianas de referencia utilizadas en este estudio fueron P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) y T.forsythia (CCUG 21028AT). Todas las cepas bacterianas se cultivaron según lo recomendado por la American Type Culture Collection (ATCC). Después del crecimiento de las bacterias hasta la fase exponencial tardía, se lavaron con agua destilada estéril y se realizó la extracción de ADN utilizando el mismo protocolo que para las muestras de placa.

La concentración y la pureza del ADN extraído se determinaron utilizando un espectrofotómetro (Nanodrop 2000, Thermo Scientific, EE. UU.). La concentración de ADN tanto de las muestras de placa como de la cepa de referencia se calculó y registró en consecuencia. Los ADN extraídos se almacenaron a -20 ⁰C hasta el inicio del procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.

Se siguió el protocolo dado por Boutaga et al., (2005) para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa. Los cebadores y las sondas seleccionados para este estudio se muestran en la Tabla 1. Se usó una mezcla de reacción total de 20 ul para la amplificación, que contiene 2 ul de ADN molde de muestra de placa/cepa de referencia, 10 ul de 2 x TaqMan fast advanced master mix (Applied biosystems, EE. UU.), 1 ul de ensayo de expresión génica 20x y 7 ul de nucleasa agua gratis Todos los componentes de la mezcla de reacción, excepto la muestra de ADN, se añadieron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. El tubo se agitó y luego se centrifugó para eliminar las burbujas de aire. La mezcla se transfirió a una placa de 96 pocillos con la adición de 2 ul de muestra de ADN. A continuación, la placa se cubrió con adhesivo óptico y se centrifugó de nuevo para asegurarse de que se eliminaban las burbujas de aire. Las condiciones de ciclado utilizadas fueron las siguientes: 50 oc durante 2 min y 95 oc durante 10 min seguido de 45 ciclos a 95 oc durante 15 s y 60 oc durante 1 min.

Se utilizaron diluciones de cantidades conocidas de cepas de ADN de referencia para generar curvas estándar con coeficiente de correlación (R2: 0,99). Para la cuantificación/determinación del número de copias, los resultados de las muestras desconocidas se proyectaron sobre las curvas estándar obtenidas de los cultivos puros utilizando la fórmula: Cantidad de ADN=10(ct-b)/m.

Determinación del nivel de Interleucina-1, Interleucina-6, Adiponectina y Factor de Necrosis Tumoral-alfa en Suero.

Se permitió que todos los reactivos alcanzaran la temperatura ambiente antes de su uso y se mezclaron suavemente antes de los experimentos. Se determinó el número de tiras de 8 pocillos necesarias para el ensayo. Se añadieron 100 ul del tampón diluyente estándar a cero pocillos y se reservó 1 pocillo para el cromógeno en blanco. Se añadieron 100 ul de patrones, muestras y controles a los pocillos de microtitulación apropiados. Se pipetearon 50 ul de solución de anti-interleucina-6 biotinilada (conjugado de biotina) en cada pocillo excepto en el blanco de cromagen y luego se golpeó suavemente en el costado de la placa para mezclar. A continuación, las placas se cubrieron con cubiertas para placas y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las soluciones se aspiraron minuciosamente de los pocillos y el líquido se descartó. Los pocillos se lavaron 4 veces. Se añadieron 100 ul de solución de trabajo de proteína rica en estreptavidina-histidina a cada pocillo excepto al blanco de cromógeno. De nuevo, las placas se cubrieron con las cubiertas de placas y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución de los pocillos se aspiró completamente y el líquido se descartó. Los pocillos se lavaron 4 veces. Se añadieron 100 ul de cromógeno estabilizado a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se agregaron 100 ul de solución de parada a cada pocillo y luego se golpeó suavemente en el costado de la placa para mezclar. La absorbancia de cada pocillo se leyó a 450 nm habiendo puesto en blanco el lector de placas frente a un cromógeno en blanco compuesto por 100 ul de cromógeno estabilizado y solución de parada. La absorbancia de los estándares frente a la concentración estándar se representó luego en papel cuadriculado.