Efeito da Terapia Periodontal Não Cirúrgica Versus Instruções de Higiene Oral em Pacientes com Periodontite Crônica

Indivíduos com periodontite crônica moderada a avançada foram selecionados para este ensaio clínico randomizado longitudinal. A autorização ética para o estudo foi concedida pelo Comitê de Ética Médica da Faculdade de Odontologia da Universidade da Malásia [Número do Comitê de Ética Médica: DF PE1002/0045(P)]. O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki de 1975, revisada em 2000. As diretrizes CONSORT para ensaios clínicos foram seguidas.

Dos 112 pacientes triados, 56 pacientes preencheram os critérios de inclusão e exclusão. Os critérios de inclusão foram mínimo de 12 dentes presentes com bolsa de 5 mm ou mais e perda de inserção de sondagem de 4 mm ou mais em pelo menos 2 quadrantes diferentes que sangraram na sondagem. Os critérios de exclusão incluíram histórico de problemas cardiovasculares, gravidez, fumantes e indivíduos recebendo antibióticos nos últimos 4 meses ou NSPT nos últimos 6 meses. Os pacientes recrutados foram tratados na clínica de Periodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade da Malásia. Usando a fórmula d de Cohen, calculou-se que seriam necessários pelo menos 26 pacientes por grupo de tratamento para detectar essa diferença com poder de 80%.

Antes do exame inicial, os pacientes foram designados para o grupo NSPT e OHI usando randomização em bloco. Os pacientes do grupo NSPT receberam OHI, raspagem e alisamento radicular seguido de colutórios com clorexidina 0,12%, enquanto os pacientes do grupo OHI receberam apenas OHI. Em cada visita de recordação mensal, os participantes de ambos os grupos foram revistos e motivados. A profilaxia profissional foi recebida apenas pelo grupo NSPT. Dois examinadores calibrados (RPCR e WNAWA) realizaram todo o tratamento nos pacientes. Profundidade de bolsa de sondagem (PPD), perda de inserção de sondagem (PAL), índice de sangramento gengival (BI) e índice de placa visível (PI) foram determinados em todos os dentes presentes, exceto terceiros molares no início e 3 meses após a terapia. Para PI e BI, 4 locais foram medidos (mesial, distal, bucal, lingual) e para PPD e PAL 6 locais foram registrados (disto-vestibular, meio-vestibular, mesio-vestibular, mesio-lingual, meio-lingual e disto- lingual). Utilizando estatísticas Kappa, bons acordos (>0,8) foram obtidos para reprodutibilidade intra e interoperador de todos os parâmetros clínicos registrados.

Identificação da microbiota subgengival usando a técnica quantitativa de reação em cadeia da polimerase.

Amostras de raspagem de placa subgengival foram obtidas no início e 3 meses após a terapia com curetas estéreis dos locais mais profundos em cada quadrante e foram agrupadas para cada indivíduo. Antes da amostragem, o isolamento foi mantido com rolos de algodão e a placa supragengival foi removida com pelotas de algodão. Os raspados de placa foram ressuspensos em 1,5 ml de solução salina tamponada com fosfato e armazenados a -80⁰C no freezer antes da extração do DNA. 100 µl de amostra de placa foram usados ​​para extração automatizada de DNA no laboratório usando a máquina Qiacube (Qiagen®, Biotechnology, Holanda). Os tubos contendo as amostras de placa foram centrifugados a uma velocidade de 5.000 × g por 10 minutos em uma centrífuga de mesa para obter o pellet. O pellet foi então usado para extração automatizada de DNA com a máquina Qiacube. 100µl de DNA eluído foi armazenado a -20⁰C para detecção bacteriana usando reação em cadeia da polimerase quantitativa (Applied Biosystem, EUA).

As cepas bacterianas de referência utilizadas neste estudo foram P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) e T.forsythia (CCUG 21028AT). Todas as cepas bacterianas foram cultivadas conforme recomendado pela American Type Culture Collection (ATCC). Após o crescimento das bactérias até a fase exponencial tardia, elas foram lavadas com água destilada estéril e a extração de DNA foi realizada usando o mesmo protocolo das amostras de placa.

A concentração e a pureza do DNA extraído foram determinadas usando máquina de espectrofotômetro (Nanodrop 2000, Thermo Scientific, EUA). A concentração de DNA de ambas as amostras de placa e cepa de referência foram calculadas e registradas de acordo. Os DNAs extraídos foram armazenados em -20⁰C até o início do procedimento quantitativo da reação em cadeia da polimerase.

O protocolo fornecido por Boutaga et al., (2005) foi seguido para a reação em cadeia da polimerase quantitativa. Os primers e sondas selecionados para este estudo são mostrados na Tabela 1. Uma mistura de reação total de 20 ul foi usada para amplificação, que contém 2 ul de DNA modelo da amostra de placa/estirpe de referência, 10 ul de 2 x TaqMan fast advanced master mix (Applied biosystems, EUA), 1 ul de ensaio de expressão gênica 20x e 7 ul de nuclease água grátis. Todos os componentes da mistura de reação, exceto a amostra de DNA, foram adicionados em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. O tubo foi agitado em vórtex e então centrifugado para eliminar as bolhas de ar. A mistura foi transferida para placa de 96 poços com adição de 2ul de amostra de DNA. A placa foi então coberta com adesivo óptico e centrifugada novamente para garantir que as bolhas de ar fossem eliminadas. As condições de ciclagem utilizadas foram as seguintes: 50oc por 2min e 95oc por 10min seguido de 45 ciclos a 95oc por 15s e 60oc por 1min.

Diluições de quantidades conhecidas de cepas de DNA de referência foram usadas para gerar curvas padrão com coeficiente de correlação (R2: 0,99). Para quantificação/determinação do número de cópias, os resultados das amostras desconhecidas foram projetados nas curvas padrão obtidas das culturas puras usando a fórmula: Quantidade de DNA=10(ct-b)/m.

Determinação do nível de Interleucina-1, Interleucina-6, Adiponectina e Fator de Necrose Tumoral-alfa no Soro.

Todos os reagentes atingiram a temperatura ambiente antes do uso e foram misturados suavemente antes dos experimentos. O número de tiras de 8 poços necessárias para o ensaio foi determinado. 100 ul do Standard Diluent Buffer foram adicionados a zero poços e 1 poço foi reservado para branco de cromogênio. 100 ul de padrões, amostras e controles foram adicionados aos poços de microtitulação apropriados. 50 ul de solução anti-interleucina-6 biotinilada (conjugado de biotina) foram pipetados em cada poço, exceto o cromagênio em branco e, em seguida, batidos suavemente na lateral da placa para misturar. Em seguida, as placas foram cobertas com tampas de placas e incubadas por 2 horas em temperatura ambiente. As soluções foram cuidadosamente aspiradas dos poços e o líquido descartado. Os poços foram lavados 4 vezes. 100 ul de solução de trabalho de proteína rica em estreptavidina-histidina foram adicionados a cada poço, exceto o branco de cromogênio. Novamente, as placas foram cobertas com as tampas de placas e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente. A solução dos poços foi completamente aspirada e o líquido descartado. Os poços foram lavados 4 vezes. 100ul de cromogênio estabilizado foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. 100 ul de solução de parada foram adicionados a cada poço e, em seguida, batidos suavemente na lateral da placa para misturar. A absorbância de cada poço foi lida a 450 nm tendo o leitor de placas em branco com um branco de cromogênio composto por 100 ul de cada um de cromogênio estabilizado e solução de parada. A absorbância dos padrões contra a concentração do padrão foi então plotada em papel milimetrado.