Effekten af ​​ikke-kirurgisk paradentoseterapi verser mundhygiejneinstruktioner på patienter med kronisk paradentose

Forsøgspersoner med moderat til fremskreden kronisk parodontitis blev udvalgt til dette longitudinelle randomiserede kliniske forsøg. Etisk godkendelse til undersøgelsen blev givet af den medicinske etiske komité, det tandlægefakultet, University of Malaya [medicinsk etisk udvalgsnummer: DF PE1002/0045(P)]. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen fra 1975, som revideret i 2000. CONSORT-retningslinjerne for kliniske forsøg blev fulgt.

Ud af 112 screenede patienter opfyldte 56 patienter inklusions- og eksklusionskriterierne. Inklusionskriterier var minimum 12 tænder til stede med lomme på 5 mm eller mere og sonderende vedhæftningstab på 4 mm eller mere i mindst 2 forskellige kvadranter, som blødte ved sondering. Eksklusionskriterier omfattede historie med kardiovaskulære problemer, graviditet, rygere og forsøgspersoner, der fik antibiotika i de seneste 4 måneder eller NSPT i de sidste 6 måneder. Rekrutterede patienter blev behandlet på parodontologisk klinik, Tandlægefakultetet, University of Malaya. Ved hjælp af Cohens d-formel blev det beregnet, at der ville være behov for mindst 26 patienter pr. behandlingsgruppe for at påvise denne forskel med 80 % effekt.

Forud for baselineundersøgelse blev patienterne tildelt NSPT- og OHI-gruppen ved hjælp af blokrandomisering. Patienter i NSPT-gruppen modtog OHI, skæl og rodplaning efterfulgt af 0,12 % klorhexidin-mundskylninger, mens patienter i OHI-gruppen kun fik OHI. Ved hver måneds tilbagekaldelsesbesøg blev deltagerne i begge grupper gennemgået og motiveret. Professionel profylakse blev kun modtaget af NSPT-gruppen. To kalibrerede undersøgere (RPCR og WNAWA) udførte al behandling på patienterne. Probing pocket depth (PPD), sonderende vedhæftningstab (PAL), gingival blødningsindeks (BI) og synlig plakindeks (PI) blev bestemt på alle nuværende tænder undtagen tredje kindtænder ved baseline og 3 måneder efter terapi. For PI og BI blev 4 steder målt (mesial, distal, bukkal, lingual) og for PPD og PAL blev 6 steder registreret (disto-bukkal, mid-bukkal, mesio-bukkal, mesio-lingual, midlingual og disto- sprogligt). Ved at bruge Kappa-statistikker blev der opnået gode overensstemmelser (>0,8) for intra- og interoperatør-reproducerbarhed af alle registrerede kliniske parametre.

Identifikation af subgingival mikrobiota ved hjælp af kvantitativ polymerasekædereaktionsteknik.

Sub-gingivale plaque-skrabningsprøver blev opnået ved baseline og 3 måneder efter terapi med sterile curetter fra de dybeste steder i hver kvadrant og blev samlet for hvert individ. Før prøveudtagning blev isolationen opretholdt med bomuldsruller, og supra-gingival plak blev fjernet ved hjælp af bomuldspellets. Plakafskrabninger blev resuspenderet i 1,5 ml fosfatbufret saltvand og opbevaret ved -80°C fryser før DNA-ekstraktion. 100 µl plakprøve blev brugt til automatiseret DNA-ekstraktion i laboratoriet ved hjælp af Qiacube-maskinen (Qiagen®, Biotechnology, Holland). Rørene indeholdende plakprøverne blev centrifugeret ved en hastighed på 5.000 x g i 10 minutter på en bordcentrifugemaskine for at opnå pelleten. Pelleten blev derefter brugt til automatiseret DNA-ekstraktion med Qiacube-maskinen. 100 µl elueret DNA blev opbevaret i -20°C til bakteriel påvisning under anvendelse af kvantitativ polymerasekædereaktion (Applied Biosystem, USA).

Referencebakteriestammer anvendt i denne undersøgelse var P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) og T.forsythia (CCUG 21028AT). Alle bakteriestammerne blev dyrket som anbefalet af American Type Culture Collection (ATCC). Efter vækst af bakterier indtil sen eksponentiel fase blev de vasket med sterilt destilleret vand, og DNA-ekstraktion blev udført under anvendelse af den samme protokol som for plakprøver.

Koncentrationen og renheden af ​​ekstraheret DNA blev bestemt ved anvendelse af spektrofotometermaskine (Nanodrop 2000, Thermo scientific, USA). DNA-koncentration fra både plakprøver og referencestamme blev beregnet og registreret i overensstemmelse hermed. De ekstraherede DNA'er blev opbevaret i -20°C indtil initieringen af ​​kvantitativ polymerasekædereaktionsprocedure.

Protokollen givet af Boutaga et al., (2005) blev fulgt for kvantitativ polymerasekædereaktion. Primere og prober udvalgt til denne undersøgelse er vist i tabel 1. En total reaktionsblanding på 20 ul blev brugt til amplifikation, som indeholder 2 ul template-DNA fra plaqueprøve/referencestamme, 10 ul 2 x TaqMan fast advanced master mix (Applied biosystems, USA), 1 ul 20x genekspressionsassay og 7 ul nuklease gratis vand. Alle komponenterne i reaktionsblandingen undtagen DNA-prøven blev tilsat i 1,5 ml mikrocentrifugerør. Røret blev vortexet og derefter centrifugeret for at eliminere luftbobler. Blandingen blev overført til 96-brønds plade med tilsætning af 2 µl DNA-prøve. Pladen blev derefter dækket med optisk klæbemiddel og centrifugeret igen for at sikre, at luftbobler blev elimineret. De anvendte cyklusbetingelser var som følger: 50 oC i 2 minutter og 95 oC i 10 minutter efterfulgt af 45 cyklusser ved 95 oC i 15 sekunder og 60 oC i 1 minut.

Fortyndinger af kendte mængder af referencestammer af DNA blev brugt til at generere standardkurver med korrelationskoefficient (R2: 0,99). Til kvantificering/kopinummerbestemmelse blev resultaterne fra ukendte prøver projiceret på standardkurverne opnået fra de rene kulturer under anvendelse af formlen: Mængde DNA=10(ct-b)/m.

Bestemmelse af interleukin-1, interleukin-6, adiponectin og tumornekrosefaktor-alfa niveau i serum.

Alle reagenser fik lov til at nå stuetemperatur før brug og blev forsigtigt blandet før eksperimenterne. Antallet af 8-brønds strimler, der var nødvendige for assayet, blev bestemt. 100 µl af standardfortyndingsbufferen blev tilsat til nul brønde, og 1 brønd blev reserveret til chromogen-blindprøve. 100 µl standarder, prøver og kontroller blev tilsat til de passende mikrotiterbrønde. 50 µl biotinyleret anti-interleukin-6 (biotinkonjugat)-opløsning blev pipetteret i hver brønd undtagen chromagen-emnet og bankede derefter forsigtigt på siden af ​​pladen for at blande. Derefter blev pladerne dækket med pladedæksler og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Opløsninger blev grundigt aspireret fra brønde, og væsken blev kasseret. Brøndene blev vasket 4 gange. 100 µl streptavidin-histidin-rig proteinarbejdsopløsning blev tilsat til hver brønd undtagen chromogen-blindprøven. Igen blev pladerne dækket med pladedækslerne og inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur. Opløsning fra brønde blev grundigt aspireret og væsken kasseret. Brøndene blev vasket 4 gange. 100 µl stabiliseret kromogen blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. 100 µl stopopløsning blev tilsat til hver brønd og derefter banket forsigtigt på siden af ​​pladen for at blande. Absorbansen af ​​hver brønd blev aflæst ved 450 nm efter at have blanket pladelæseren mod et chromogen-blindprøve bestående af 100 µl hver af Stabilized Chromogen og Stop Solution. Absorbansen af ​​standarderne mod standardkoncentrationen blev derefter afbildet på millimeterpapir.