Účinek nechirurgické parodontální terapie ve verších o instrukcích orální hygieny na pacienty s chronickou parodontitidou

Pro tuto longitudinální randomizovanou klinickou studii byli vybráni jedinci se středně pokročilou až pokročilou chronickou parodontitidou. Etická atestace pro studii byla udělena lékařskou etickou komisí Fakulty zubního lékařství, University of Malaya [Číslo lékařské etické komise: DF PE1002/0045(P)]. Studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací z roku 1975, revidovanou v roce 2000. Byly dodrženy pokyny CONSORT pro klinické studie.

Ze 112 vyšetřených pacientů splnilo kritéria pro zařazení a vyloučení 56 pacientů. Kritéria pro zařazení byla minimálně 12 přítomných zubů s kapsou 5 mm nebo více a ztráta uchycení sondy 4 mm nebo více v alespoň 2 různých kvadrantech, které při sondování krvácely. Kritéria vyloučení zahrnovala anamnézu kardiovaskulárních problémů, těhotenství, kuřáky a subjekty užívající antibiotika v posledních 4 měsících nebo NSPT v posledních 6 měsících. Rekrutovaní pacienti byli léčeni na parodontologické klinice Fakulty zubního lékařství Malajské univerzity. Pomocí Cohenova d vzorce bylo vypočteno, že by bylo zapotřebí alespoň 26 pacientů na léčebnou skupinu, aby bylo možné tento rozdíl detekovat s 80% silou.

Před vstupním vyšetřením byli pacienti zařazeni do skupiny NSPT a OHI pomocí blokové randomizace. Pacienti ve skupině NSPT dostávali OHI, odlupování a hoblování kořenů následované výplachy úst 0,12% chlorhexidinem, zatímco pacienti ve skupině OHI dostávali pouze OHI. Při každé měsíční návštěvě byli účastníci v obou skupinách přezkoumáni a motivováni. Profesionální profylaxi dostávala pouze skupina NSPT. Veškerou léčbu pacientů provedli dva kalibrovaní vyšetřující (RPCR a WNAWA). Hloubka kapsy sondy (PPD), ztráta přichycení sondy (PAL), index krvácení dásní (BI) a index viditelného plaku (PI) byly stanoveny u všech přítomných zubů kromě třetích molárů na začátku a 3 měsíce po terapii. Pro PI a BI byla měřena 4 místa (meziální, distální, bukální, lingvální) a pro PPD a PAL bylo zaznamenáno 6 míst (distobukální, střední bukální, mesio-bukální, meziolingvální, střední jazyk a disto- lingvální). S využitím Kappa statistiky byly získány dobré shody (>0,8) pro intra a interoperabilní reprodukovatelnost všech zaznamenaných klinických parametrů.

Identifikace subgingivální mikroflóry pomocí techniky kvantitativní polymerázové řetězové reakce.

Vzorky subgingiválního škrábání plaku byly získány na začátku a 3 měsíce po terapii sterilními kyretami z nejhlubších míst v každém kvadrantu a byly shromážděny pro každý subjekt. Před odběrem vzorků byla izolace udržována bavlněnými smotky a supragingivální plak byl odstraněn pomocí bavlněných pelet. Seškraby plaků byly resuspendovány v 1,5 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku a před extrakcí DNA skladovány při -80 °C v mrazáku. 100 ul vzorku plaku bylo použito pro automatizovanou extrakci DNA v laboratoři za použití přístroje Qiacube (Qiagen®, Biotechnology, Nizozemsko). Zkumavky obsahující vzorky plaků byly centrifugovány při rychlosti 5000 x g po dobu 10 minut na stolním odstředivce, aby se získala peleta. Peleta byla poté použita pro automatickou extrakci DNA pomocí zařízení Qiacube. 100 ul eluované DNA bylo skladováno při -20 °C pro bakteriální detekci pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (Applied Biosystem, USA).

Referenční bakteriální kmeny použité v této studii byly P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) a T.forsythia (CCUG 21028AT). Všechny bakteriální kmeny byly pěstovány podle doporučení American Type Culture Collection (ATCC). Po růstu bakterií do pozdní exponenciální fáze byly promyty sterilní destilovanou vodou a extrakce DNA byla provedena za použití stejného protokolu jako u vzorků plaků.

Koncentrace a čistota extrahované DNA byla stanovena pomocí spektrofotometru (Nanodrop 2000, Thermo science, USA). Koncentrace DNA ze vzorků plaků a referenčního kmene byla vypočtena a zaznamenána podle toho. Extrahované DNA byly skladovány při -20 °C až do zahájení kvantitativní polymerázové řetězové reakce.

Pro kvantitativní polymerázovou řetězovou reakci byl dodržen protokol uvedený Boutagou et al., (2005). Primery a sondy vybrané pro tuto studii jsou uvedeny v tabulce 1. Pro amplifikaci byla použita celková reakční směs o objemu 20 ul, která obsahuje 2 ul templátové DNA ze vzorku plaku/referenčního kmene, 10 ul 2 x TaqMan fast advanced master mix (Applied biosystems, USA), 1 ul 20x testu genové exprese a 7 ul nukleázy volná voda. Všechny složky reakční směsi kromě vzorku DNA byly přidány do 1,5ml mikrocentrifugační zkumavky. Zkumavka byla vortexována a poté odstředěna, aby se odstranily vzduchové bubliny. Směs byla přenesena na 96-jamkovou destičku s přidáním 2 ul vzorku DNA. Destička byla poté pokryta optickým lepidlem a znovu odstředěna, aby se zajistilo odstranění vzduchových bublin. Použité podmínky cyklování byly následující: 50 °C po dobu 2 minut a 95 °C po dobu 10 minut následovaných 45 cykly při 95 °C po dobu 15 s a 60 °C po dobu 1 minuty.

Ředění známých množství referenčních kmenů DNA byla použita pro vytvoření standardních křivek s korelačním koeficientem (R2: 0,99). Pro kvantifikaci/určení počtu kopií byly výsledky z neznámých vzorků promítnuty do standardních křivek získaných z čistých kultur pomocí vzorce: Množství DNA=10(ct-b)/m.

Stanovení hladiny interleukinu-1, interleukinu-6, adiponektinu a tumor nekrotizujícího faktoru-alfa v séru.

Všechna činidla se před použitím nechala dosáhnout teploty místnosti a před experimenty se jemně promíchala. Byl stanoven počet 8jamkových proužků potřebných pro test. 100 ul standardního ředícího pufru bylo přidáno do nula jamek a 1 jamka byla vyhrazena pro chromogen blank. 100 ul standardů, vzorků a kontrol bylo přidáno do příslušných mikrotitračních jamek. 50 ul roztoku biotinylovaného anti-interleukinu-6 (konjugát biotinu) bylo napipetováno do každé jamky kromě chromagenového blanku a poté jemně poklepáno na stranu destičky, aby se promíchalo. Dále byly destičky zakryty kryty destiček a inkubovány po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Roztoky byly důkladně odsáty z jamek a kapalina byla odstraněna. Jamky byly 4krát promyty. 100 ul pracovního roztoku proteinu bohatého na streptavidin-histidin bylo přidáno do každé jamky kromě chromogenového slepého pokusu. Destičky byly opět zakryty kryty destiček a inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Roztok z jamek byl důkladně odsát a kapalina zlikvidována. Jamky byly 4krát promyty. Do každé jamky bylo přidáno 100 ul stabilizovaného chromogenu. Destičky byly inkubovány po dobu 30 minut při teplotě místnosti ve tmě. Do každé jamky se přidalo 100 ul zastavovacího roztoku a poté se jemně poklepalo na stranu destičky, aby se promíchalo. Absorbance každé jamky byla odečtena při 450 nm, přičemž byla čtečka destiček zatemněna proti chromogenovému slepému pokusu složenému ze 100 ul stabilizovaného chromogenu a stop roztoku. Absorbance standardů proti standardní koncentraci pak byla vynesena na milimetrový papír.