Effect van niet-chirurgische parodontale therapie Verzen mondhygiëne-instructies op patiënten met chronische parodontitis

Proefpersonen met matige tot gevorderde chronische parodontitis werden geselecteerd voor deze longitudinale gerandomiseerde klinische studie. Ethische goedkeuring voor de studie werd verleend door de medisch-ethische commissie, faculteit tandheelkunde, universiteit van Malaya [Medisch-ethische commissienummer: DF PE1002/0045(P)]. De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki van 1975, zoals herzien in 2000. De CONSORT-richtlijnen voor klinische onderzoeken werden gevolgd.

Van de 112 gescreende patiënten voldeden 56 patiënten aan de in- en exclusiecriteria. Criteria voor opname waren minimaal 12 aanwezige tanden met een pocket van 5 mm of meer en verlies van 4 mm of meer sondeeraanhechting in ten minste 2 verschillende kwadranten die bloedden bij sonderen. Uitsluitingscriteria waren onder meer een voorgeschiedenis van cardiovasculaire problemen, zwangerschap, rokers en proefpersonen die in de afgelopen 4 maanden antibiotica kregen of NSPT in de afgelopen 6 maanden. Gerekruteerde patiënten werden behandeld in de Parodontologiekliniek, Faculteit der Tandheelkunde, Universiteit van Malaya. Met behulp van de d-formule van Cohen werd berekend dat per behandelgroep minimaal 26 patiënten nodig zouden zijn om dit verschil met 80% power te detecteren.

Voorafgaand aan het basisonderzoek werden patiënten ingedeeld in de NSPT- en OHI-groep met behulp van blokrandomisatie. Patiënten in de NSPT-groep kregen OHI, scaling en wortelschaven gevolgd door 0,12% chloorhexidine mondspoelingen, terwijl patiënten in de OHI-groep alleen OHI kregen. Bij elk maandelijks herinneringsbezoek werden de deelnemers in beide groepen beoordeeld en gemotiveerd. Professionele profylaxe werd alleen ontvangen door de NSPT-groep. Twee gekalibreerde examinatoren (RPCR en WNAWA) voerden alle behandelingen uit bij de patiënten. De diepte van de pocket (PPD), het verlies van de sondeaanhechting (PAL), de gingivale bloedingsindex (BI) en de zichtbare plaque-index (PI) werden bepaald op alle aanwezige tanden behalve de derde molaren bij baseline en 3 maanden na de therapie. Voor PI en BI werden 4 plaatsen gemeten (mesiaal, distaal, buccaal, linguaal) en voor PPD en PAL werden 6 plaatsen geregistreerd (disto-buccaal, mid-buccaal, mesio-buccaal, mesio-linguaal, mid-linguaal en disto-buccaal). linguaal). Met behulp van Kappa-statistieken werden goede overeenkomsten (>0,8) verkregen voor intra- en interoperatorreproduceerbaarheid van alle geregistreerde klinische parameters.

Identificatie van subgingivale microbiota met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactietechniek.

Subgingivale plakafschraapmonsters werden verkregen bij aanvang en 3 maanden na de therapie met steriele curettes uit de diepste plaatsen in elk kwadrant en werden samengevoegd voor elke proefpersoon. Voorafgaand aan de bemonstering werd de isolatie gehandhaafd met wattenrollen en werd supragingivale plaque verwijderd met behulp van wattenpellets. Plaqueschraapsel werd opnieuw gesuspendeerd in 1,5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing en opgeslagen bij een vriezer van -80°C voorafgaand aan DNA-extractie. 100 µl plaquemonster werd gebruikt voor geautomatiseerde DNA-extractie in het laboratorium met behulp van de Qiacube-machine (Qiagen®, Biotechnology, Nederland). De buisjes met de plaquemonsters werden gedurende 10 minuten gecentrifugeerd met een snelheid van 5.000 x g op een tafelmodel centrifuge om de pellet te verkrijgen. De pellet werd vervolgens gebruikt voor geautomatiseerde DNA-extractie met de Qiacube-machine. 100 µl geëlueerd DNA werd bewaard bij -20°C voor bacteriële detectie met behulp van kwantitatieve polymerasekettingreactie (Applied Biosystem, VS).

De in deze studie gebruikte referentiebacteriestammen waren P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) en T.forsythia (CCUG 21028AT). Alle bacteriestammen werden gekweekt zoals aanbevolen door American Type Culture Collection (ATCC). Na de groei van bacteriën tot de late exponentiële fase werden ze gewassen met steriel gedestilleerd water en DNA-extractie werd uitgevoerd volgens hetzelfde protocol als voor plaquemonsters.

De concentratie en zuiverheid van geëxtraheerd DNA werd bepaald met behulp van een spectrofotometermachine (Nanodrop 2000, Thermo Scientific, VS). De DNA-concentratie van zowel plaquemonsters als referentiestam werd dienovereenkomstig berekend en geregistreerd. De geëxtraheerde DNA's werden bewaard bij -20⁰C tot de start van de kwantitatieve polymerasekettingreactieprocedure.

Het protocol van Boutaga et al., (2005) werd gevolgd voor kwantitatieve polymerasekettingreactie. Primers en sondes die voor dit onderzoek zijn geselecteerd, worden weergegeven in tabel 1. Een totaal reactiemengsel van 20 µl werd gebruikt voor amplificatie, dat 2 µl template-DNA van plaquemonster/referentiestam, 10 µl van 2 x TaqMan fast advanced master mix (Applied biosystems, VS), 1 µl van 20x genexpressietest en 7 µl nuclease bevat. gratis water. Alle componenten van het reactiemengsel behalve het DNA-monster werden toegevoegd in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. De buis werd gevortext en vervolgens gecentrifugeerd om luchtbellen te verwijderen. Het mengsel werd overgebracht naar een plaat met 96 putjes met toevoeging van 2 µl DNA-monster. De plaat werd vervolgens bedekt met optische kleefstof en opnieuw gecentrifugeerd om er zeker van te zijn dat luchtbellen werden verwijderd. De gebruikte cyclusomstandigheden waren als volgt: 50°C gedurende 2 minuten en 95°C gedurende 10 minuten gevolgd door 45 cycli bij 95°C gedurende 15 seconden en 60°C gedurende 1 minuut.

Verdunningen van bekende hoeveelheden referentie-DNA-stammen werden gebruikt om standaardkrommen met correlatiecoëfficiënt te genereren (R2: 0,99). Voor kwantificering/bepaling van het aantal kopieën werden de resultaten van onbekende monsters geprojecteerd op de standaardkrommen verkregen uit de zuivere kweken met behulp van de formule: Hoeveelheid DNA=10(ct-b)/m.

Bepaling van interleukine-1, interleukine-6, adiponectine en tumornecrosefactor-alfa-niveau in serum.

Alle reagentia mochten vóór gebruik op kamertemperatuur komen en werden voorafgaand aan de experimenten voorzichtig gemengd. Het aantal strips met 8 putjes dat nodig was voor de assay werd bepaald. 100 µl van de standaardverdunningsbuffer werd toegevoegd aan nul putjes en 1 putje werd gereserveerd voor chromogeenblanco. 100 µl standaarden, monsters en controles werden toegevoegd aan de geschikte microtiterputjes. 50 µl gebiotinyleerde anti-interleukine-6 ​​(biotineconjugaat)-oplossing werd in elk putje gepipetteerd behalve de chromagenblanco en vervolgens zachtjes op de zijkant van de plaat getikt om te mengen. Vervolgens werden de platen afgedekt met plaatdeksels en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Oplossingen werden grondig uit putjes gezogen en de vloeistof werd weggegooid. De putjes werden 4 keer gewassen. 100 µl streptavidine-histidine-rijke eiwitwerkoplossing werd toegevoegd aan elk putje behalve de chromogeenblanco. Wederom werden de platen bedekt met de plaatdeksels en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Oplossing uit putjes werd grondig afgezogen en de vloeistof weggegooid. De putjes werden 4 keer gewassen. Aan elk putje werd 100 µl gestabiliseerd chromogeen toegevoegd. De platen werden 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. 100 µl stopoplossing werd aan elk putje toegevoegd en vervolgens zachtjes op de zijkant van de plaat getikt om te mengen. De absorptie van elk putje werd afgelezen bij 450 nm nadat de plaatlezer was afgezet tegen een chromogeenblanco samengesteld uit 100 µl elk van gestabiliseerd chromogeen en stopoplossing. De absorptie van de standaarden tegen de standaardconcentratie werd vervolgens uitgezet op grafiekpapier.