慢性歯周炎患者に対する非外科的歯周治療と口腔衛生指導の効果

この縦断的ランダム化臨床試験には、中等度から進行の慢性歯周炎の被験者が選ばれました。 この研究の倫理的許可は、マラヤ大学歯学部医倫理委員会によって与えられました[医倫理委員会番号: DF PE1002/0045(P)]。 この研究は、2000 年に改訂された 1975 年のヘルシンキ宣言に従って実施されました。 臨床試験のための CONSORT ガイドラインに従いました。

スクリーニングされた患者 112 人のうち、56 人の患者が包含基準および除外基準を満たしました。 対象基準は、少なくとも 2 つの異なる象限で 5mm 以上のポケットとプロービング時に出血する 4mm 以上のプロービング付着損失が存在する歯が 12 本以上であることでした。 除外基準には、心血管疾患の病歴、妊娠、喫煙者、過去4か月以内に抗生物質または過去6か月以内にNSPTを受けている被験者が含まれた。 募集された患者は、マラヤ大学歯学部の歯周病クリニックで治療を受けました。 コーエンの d 式を使用すると、この差異を 80% の検出力で検出するには、治療グループごとに少なくとも 26 人の患者が必要であると計算されました。

ベースライン検査の前に、患者はブロックランダム化を使用して NSPT グループと OHI グループに割り当てられました。 NSPTグループの患者はOHI、スケーリング、ルートプレーニングを行った後、0.12%クロルヘキシジンの洗口を受けましたが、OHIグループの患者はOHIのみを受けました。 毎月の回想訪問で、両方のグループの参加者がレビューされ、モチベーションが高まりました。 専門的な予防措置は NSPT グループのみが受けました。 2 人の校正された検査官 (RPCR と WNAWA) が患者のすべての治療を実行しました。 プロービングポケット深さ（PPD）、プロービングアタッチメントロス（PAL）、歯肉出血指数（BI）、および可視プラーク指数（PI）を、ベースライン時および治療後3か月時に、第三大臼歯を除くすべての現在の歯について測定しました。 PI と BI では 4 部位 (近心、遠心、頬側、舌側) が測定され、PPD と PAL では 6 部位 (遠心頬側、中部頬側、近心頬側、近心舌側、中間舌側、遠心側) が記録されました。言語的）。 カッパ統計を利用すると、記録されたすべての臨床パラメーターの術者内および術者間の再現性について良好な一致 (>0.8) が得られました。

定量的ポリメラーゼ連鎖反応技術を使用した歯肉縁下の微生物叢の同定。

ベースライン時および治療後 3 か月後に、各象限の最も深い部位から滅菌キュレットを使用して歯肉下のプラークを削り取ったサンプルを採取し、被験者ごとにプールしました。 サンプリングの前に、綿ロールで隔離を維持し、綿ペレットを使用して歯肉縁上のプラークを除去しました。 プラークの掻き取りを1.5 mlのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、DNA抽出前に-80℃の冷凍庫で保存しました。 100μlのプラークサンプルを、Qiacubeマシン（Qiagen®、Biotechnology、オランダ）を使用した研究室での自動DNA抽出に使用しました。 プラークサンプルを含むチューブを卓上遠心分離機で 5,000 × g の速度で 10 分間遠心分離し、ペレットを得ました。 次に、ペレットを Qiacube マシンによる自動 DNA 抽出に使用しました。 定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (Applied Biosystem, USA) を使用した細菌検出のために、溶出した DNA 100 μl を -20℃ で保存しました。

この研究で使用した参照細菌株は、P.gingivalis (W83)、A.actinomycetemcomitans (NCTC9710)、P.intermedia (ATCC25611)、および T.forsythia (CCUG 21028AT) でした。 すべての細菌株は、American Type Culture Collection (ATCC) の推奨に従って増殖させました。 対数期後期まで細菌が増殖した後、細菌を滅菌蒸留水で洗浄し、プラークサンプルの場合と同じプロトコールを使用して DNA 抽出を実行しました。

抽出された DNA の濃度と純度は、分光光度計 (Nanodrop 2000、Thermo Scientific、米国) を使用して測定されました。 プラークサンプルと参照株の両方からの DNA 濃度を計算し、それに応じて記録しました。 抽出した DNA は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応手順を開始するまで -20℃ で保存しました。

定量的ポリメラーゼ連鎖反応については、Boutaga et al., (2005) によって与えられたプロトコールに従いました。 この研究のために選択されたプライマーとプローブを表 1 に示します。 合計20μlの反応混合物を増幅に使用しました。これには、プラークサンプル/参照株からのテンプレートDNA 2μl、2×TaqMan fast Advanced Master mix（Applied biosystems、米国）10μl、20×遺伝子発現アッセイ1μl、およびヌクレアーゼ7μlが含まれます。無料の水。 DNAサンプルを除く反応混合物のすべての成分を1.5mlの微量遠心分離管に加えた。 チューブをボルテックスし、その後遠心分離して気泡を除去した。 混合物を９６ウェルプレートに移し、２μｌのＤＮＡサンプルを加えた。 次に、プレートを光学接着剤で覆い、再度遠心分離して気泡が確実に除去されるようにしました。 使用したサイクリング条件は次のとおりです。50℃で2分間、95℃で10分間、その後95℃で15秒間、60℃で1分間を45サイクルしました。

既知量の参照 DNA 株の希釈液を使用して、相関係数 (R2: 0.99) を持つ標準曲線を作成しました。 定量/コピー数の決定では、未知のサンプルからの結果を、式: DNA 量 = 10(ct-b)/m を使用して純粋培養から得られた標準曲線に投影しました。

血清中のインターロイキン-1、インターロイキン-6、アディポネクチンおよび腫瘍壊死因子αレベルの測定。

すべての試薬は使用前に室温に戻し、実験前に穏やかに混合しました。 アッセイに必要な 8 ウェル ストリップの数が決定されました。 １００μｌの標準希釈緩衝液を０個のウェルに加え、１個のウェルを色原体ブランク用に取った。 100μlの標準、サンプルおよび対照を適切なマイクロタイターウェルに加えた。 ５０μｌのビオチン化抗インターロイキン６（ビオチン複合体）溶液を、クロマゲンブランクを除く各ウェルにピペットで取り、プレートの側面を軽く叩いて混合した。 次に、プレートをプレートカバーで覆い、室温で２時間インキュベートした。 溶液をウェルから完全に吸引し、液体を廃棄した。 ウェルを４回洗浄した。 100μlのストレプトアビジン-ヒスチジン-リッチタンパク質作業溶液を、色原体ブランクを除く各ウェルに添加した。 再度、プレートをプレートカバーで覆い、室温で30分間インキュベートした。 ウェルからの溶液を完全に吸引し、液体を廃棄した。 ウェルを４回洗浄した。 100μlの安定化色原体を各ウェルに添加した。 プレートを暗所、室温で30分間インキュベートした。 １００μｌの停止溶液を各ウェルに添加し、次いでプレートの側面を軽く叩いて混合した。 各ウェルの吸光度を、各１００μｌの安定化色原体および停止溶液からなる色原体ブランクに対してプレートリーダーをブランクにして、４５０ｎｍで読み取った。 次に、標準濃度に対する標準の吸光度をグラフ用紙にプロットしました。