Effetto della terapia parodontale non chirurgica rispetto alle istruzioni di igiene orale sui pazienti con parodontite cronica

I soggetti con parodontite cronica da moderata a avanzata sono stati selezionati per questo studio clinico longitudinale randomizzato. L'autorizzazione etica per lo studio è stata concessa dal Comitato etico medico, Facoltà di odontoiatria, Università della Malesia [Numero comitato etico medico: DF PE1002/0045(P)]. Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki del 1975, rivista nel 2000. Sono state seguite le linee guida CONSORT per gli studi clinici.

Su 112 pazienti sottoposti a screening, 56 pazienti soddisfacevano i criteri di inclusione ed esclusione. I criteri di inclusione erano almeno 12 denti presenti con tasca di 5 mm o più e perdita di attacco al sondaggio di 4 mm o più in almeno 2 diversi quadranti che sanguinavano al sondaggio. I criteri di esclusione includevano storia di problemi cardiovascolari, gravidanza, fumatori e soggetti che avevano ricevuto antibiotici negli ultimi 4 mesi o NSPT negli ultimi 6 mesi. I pazienti reclutati sono stati curati presso la clinica di parodontologia, Facoltà di Odontoiatria, Università della Malesia. Utilizzando la formula d di Cohen è stato calcolato che sarebbero necessari almeno 26 pazienti per gruppo di trattamento per rilevare questa differenza con una potenza dell'80%.

Prima dell'esame di riferimento, i pazienti sono stati assegnati al gruppo NSPT e OHI utilizzando la randomizzazione a blocchi. I pazienti nel gruppo NSPT hanno ricevuto OHI, detartrasi e levigatura radicolare seguiti da collutori con clorexidina allo 0,12%, mentre i pazienti nel gruppo OHI hanno ricevuto solo OHI. Ad ogni visita di richiamo mensile, i partecipanti di entrambi i gruppi sono stati esaminati e motivati. La profilassi professionale è stata ricevuta solo dal gruppo NSPT. Due esaminatori calibrati (RPCR e WNAWA) hanno eseguito tutti i trattamenti sui pazienti. La profondità della tasca al sondaggio (PPD), la perdita di attacco al sondaggio (PAL), l'indice di sanguinamento gengivale (BI) e l'indice di placca visibile (PI) sono stati determinati su tutti i denti presenti tranne i terzi molari al basale e 3 mesi dopo la terapia. Per PI e BI, sono stati misurati 4 siti (mesiale, distale, buccale, linguale) e per PPD e PAL sono stati registrati 6 siti (disto-buccale, medio-buccale, mesio-buccale, mesio-linguale, medio-linguale e disto-buccale). linguale). Utilizzando le statistiche Kappa, sono stati ottenuti buoni accordi (>0,8) per la riproducibilità intra e inter operatore di tutti i parametri clinici registrati.

Identificazione del microbiota sottogengivale mediante tecnica di reazione a catena della polimerasi quantitativa.

I campioni di raschiamento della placca sottogengivale sono stati ottenuti al basale e 3 mesi dopo la terapia con curette sterili dai siti più profondi di ciascun quadrante e sono stati raggruppati insieme per ciascun soggetto. Prima del campionamento, l'isolamento è stato mantenuto con rulli di cotone e la placca sopragengivale è stata rimossa utilizzando palline di cotone. I raschiati della placca sono stati risospesi in 1,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato e conservati a -80°C nel congelatore prima dell'estrazione del DNA. 100 µl di campione di placca sono stati utilizzati per l'estrazione automatizzata del DNA in laboratorio utilizzando la macchina Qiacube (Qiagen®, Biotechnology, Paesi Bassi). Le provette contenenti i campioni di placca sono state centrifugate a una velocità di 5.000 × g per 10 minuti su una centrifuga da tavolo per ottenere il pellet. Il pellet è stato quindi utilizzato per l'estrazione automatizzata del DNA con la macchina Qiacube. 100 µl di DNA eluito sono stati conservati a -20⁰C per il rilevamento batterico utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa (Applied Biosystem, USA).

I ceppi batterici di riferimento utilizzati in questo studio erano P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) e T.forsythia (CCUG 21028AT). Tutti i ceppi batterici sono stati coltivati ​​come raccomandato dall'American Type Culture Collection (ATCC). Dopo la crescita dei batteri fino alla fase esponenziale tardiva, sono stati lavati con acqua distillata sterile e l'estrazione del DNA è stata effettuata utilizzando lo stesso protocollo utilizzato per i campioni di placca.

La concentrazione e la purezza del DNA estratto è stata determinata utilizzando una macchina spettrofotometrica (Nanodrop 2000, Thermo scientific, USA). La concentrazione di DNA sia dei campioni di placca che del ceppo di riferimento è stata calcolata e registrata di conseguenza. I DNA estratti sono stati conservati a -20⁰C fino all'inizio della procedura di reazione a catena della polimerasi quantitativa.

Il protocollo fornito da Boutaga et al., (2005) è stato seguito per la reazione a catena della polimerasi quantitativa. I primer e le sonde selezionati per questo studio sono mostrati nella Tabella 1. Per l'amplificazione è stata utilizzata una miscela di reazione totale di 20 ul, che contiene 2 ul di DNA modello da campione di placca/ceppo di riferimento, 10 ul di master mix TaqMan fast advanced 2 x (Applied biosystems, USA), 1 ul di test di espressione genica 20x e 7 ul di nucleasi acqua gratis. Tutti i componenti della miscela di reazione ad eccezione del campione di DNA sono stati aggiunti in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml. La provetta è stata sottoposta a vortex e quindi centrifugata per eliminare le bolle d'aria. La miscela è stata trasferita in una piastra a 96 pozzetti con l'aggiunta di 2 ul di campione di DNA. La lastra è stata quindi ricoperta con adesivo ottico e centrifugata nuovamente per assicurarsi che le bolle d'aria vengano eliminate. Le condizioni di ciclo usate erano le seguenti: 50oc per 2min e 95oc per 10min seguiti da 45 cicli a 95oc per 15s e 60oc per 1min.

Diluizioni di quantità note di ceppi di DNA di riferimento sono state utilizzate per generare curve standard con coefficiente di correlazione (R2: 0,99). Per la quantificazione/determinazione del numero di copie, i risultati dei campioni sconosciuti sono stati proiettati sulle curve standard ottenute dalle colture pure utilizzando la formula: Quantità DNA=10(ct-b)/m.

Determinazione del livello di Interleuchina-1, Interleuchina-6, Adiponectina e Tumor Necrosis Factor-alfa nel siero.

Tutti i reagenti sono stati lasciati raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso e sono stati miscelati delicatamente prima degli esperimenti. È stato determinato il numero di strisce da 8 pozzetti necessarie per l'analisi. 100 ul del tampone diluente standard sono stati aggiunti a zero pozzetti e 1 pozzetto è stato riservato per il bianco cromogeno. 100 ul di standard, campioni e controlli sono stati aggiunti ai micropozzetti appropriati. 50 ul di soluzione biotinilata di anti-interleuchina-6 (coniugato di biotina) sono stati pipettati in ciascun pozzetto ad eccezione del bianco di cromogeno e quindi picchiettati delicatamente sul lato della piastra per miscelare. Successivamente, le piastre sono state coperte con copripiastre e incubate per 2 ore a temperatura ambiente. Le soluzioni sono state accuratamente aspirate dai pozzetti e il liquido scartato. I pozzetti sono stati lavati 4 volte. 100 ul di soluzione di lavoro proteica ricca di streptavidina-istidina sono stati aggiunti a ciascun pozzetto ad eccezione del bianco cromogeno. Ancora una volta, le piastre sono state coperte con i coperchi delle piastre e incubate per 30 minuti a temperatura ambiente. La soluzione dai pozzetti è stata completamente aspirata e il liquido è stato scartato. I pozzetti sono stati lavati 4 volte. Ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 100 ul di cromogeno stabilizzato. Le piastre sono state incubate per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. 100 ul di soluzione di arresto sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e quindi picchiettati delicatamente sul lato della piastra per miscelare. L'assorbanza di ciascun pozzetto è stata letta a 450 nm dopo aver oscurato il lettore di piastre contro un bianco di cromogeno composto da 100 ul ciascuno di cromogeno stabilizzato e soluzione bloccante. L'assorbanza degli standard rispetto alla concentrazione standard è stata quindi tracciata su carta millimetrata.