Effet de la thérapie parodontale non chirurgicale par rapport aux instructions d'hygiène buccale sur les patients atteints de parodontite chronique

Des sujets atteints de parodontite chronique modérée à avancée ont été sélectionnés pour cet essai clinique randomisé longitudinal. L'autorisation éthique de l'étude a été accordée par le comité d'éthique médicale de la faculté de médecine dentaire de l'université de Malaya [numéro du comité d'éthique médicale : DF PE1002/0045(P)]. L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki de 1975, telle que révisée en 2000. Les directives CONSORT pour les essais cliniques ont été suivies.

Sur 112 patients dépistés, 56 patients remplissaient les critères d'inclusion et d'exclusion. Les critères d'inclusion étaient un minimum de 12 dents présentes avec une poche de 5 mm ou plus et une perte d'attache au sondage de 4 mm ou plus dans au moins 2 quadrants différents qui saignaient au sondage. Les critères d'exclusion comprenaient les antécédents de problèmes cardiovasculaires, la grossesse, les fumeurs et les sujets recevant des antibiotiques au cours des 4 derniers mois ou NSPT au cours des 6 derniers mois. Les patients recrutés ont été traités à la clinique de parodontologie, Faculté de médecine dentaire, Université de Malaya. En utilisant la formule d de Cohen, il a été calculé qu'au moins 26 patients seraient nécessaires par groupe de traitement pour détecter cette différence avec une puissance de 80 %.

Avant l'examen initial, les patients ont été répartis dans le groupe NSPT et OHI en utilisant la randomisation en bloc. Les patients du groupe NSPT ont reçu l'OHI, le détartrage et le surfaçage radiculaire suivis de bains de bouche à la chlorhexidine à 0,12 %, tandis que les patients du groupe OHI n'ont reçu que l'OHI. À chaque visite de rappel mensuelle, les participants des deux groupes ont été examinés et motivés. La prophylaxie professionnelle n'a été reçue que par le groupe NSPT. Deux examinateurs calibrés (RPCR et WNAWA) ont effectué tous les traitements sur les patients. La profondeur de poche au sondage (PPD), la perte d'attache au sondage (PAL), l'indice de saignement gingival (IB) et l'indice de plaque visible (IP) ont été déterminés sur toutes les dents présentes à l'exception des troisièmes molaires au départ et 3 mois après le traitement. Pour PI et BI, 4 sites ont été mesurés (mésial, distal, buccal, lingual) et pour PPD et PAL 6 sites ont été enregistrés (disto-buccal, médio-buccal, mésio-buccal, mésio-lingual, médio-lingual et disto-buccal). lingual). En utilisant les statistiques Kappa, de bons accords (>0,8) ont été obtenus pour la reproductibilité intra et inter opérateur de tous les paramètres cliniques enregistrés.

Identification du microbiote sous-gingival à l'aide de la technique quantitative de réaction en chaîne par polymérase.

Des échantillons de grattage de plaque sous-gingivale ont été obtenus au départ et 3 mois après le traitement avec des curettes stériles des sites les plus profonds de chaque quadrant et ont été regroupés pour chaque sujet. Avant l'échantillonnage, l'isolement a été maintenu avec des rouleaux de coton et la plaque supra-gingivale a été éliminée à l'aide de boulettes de coton. Les grattages de plaque ont été remis en suspension dans 1,5 ml de solution saline tamponnée au phosphate et stockés au congélateur à -80°C avant l'extraction de l'ADN. 100 µl d'échantillon de plaque ont été utilisés pour l'extraction automatisée d'ADN en laboratoire à l'aide de la machine Qiacube (Qiagen®, Biotechnology, Pays-Bas). Les tubes contenant les échantillons de plaque ont été centrifugés à une vitesse de 5 000 × g pendant 10 minutes sur une centrifugeuse de table pour obtenir le culot. Le culot a ensuite été utilisé pour l'extraction automatisée d'ADN avec la machine Qiacube. 100 µl d'ADN élué ont été stockés à -20°C pour la détection bactérienne en utilisant une réaction en chaîne par polymérase quantitative (Applied Biosystem, USA).

Les souches bactériennes de référence utilisées dans cette étude étaient P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) et T.forsythia (CCUG 21028AT). Toutes les souches bactériennes ont été cultivées selon les recommandations de l'American Type Culture Collection (ATCC). Après la croissance des bactéries jusqu'à la phase exponentielle tardive, elles ont été lavées avec de l'eau distillée stérile et l'extraction de l'ADN a été effectuée en utilisant le même protocole que pour les échantillons de plaque.

La concentration et la pureté de l'ADN extrait ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre (Nanodrop 2000, Thermo Scientific, USA). La concentration d'ADN des échantillons de plaque et de la souche de référence a été calculée et enregistrée en conséquence. Les ADN extraits ont été stockés à -20⁰C jusqu'à l'initiation de la procédure de réaction en chaîne par polymérase quantitative.

Le protocole donné par Boutaga et al., (2005) a été suivi pour la réaction en chaîne par polymérase quantitative. Les amorces et les sondes sélectionnées pour cette étude sont présentées dans le tableau 1. Un mélange réactionnel total de 20 ul a été utilisé pour l'amplification, qui contient 2 ul d'ADN matrice provenant d'un échantillon de plaque/souche de référence, 10 ul de 2 x TaqMan fast advanced master mix (Applied biosystems, États-Unis), 1 ul de test d'expression génique 20x et 7 ul de nucléase eau gratuite. Tous les composants du mélange réactionnel à l'exception de l'échantillon d'ADN ont été ajoutés dans un microtube de centrifugation de 1,5 ml. Le tube a été vortexé puis centrifugé pour éliminer les bulles d'air. Le mélange a été transféré dans une plaque à 96 puits avec addition de 2 ul d'échantillon d'ADN. La plaque a ensuite été recouverte d'adhésif optique et centrifugée à nouveau pour s'assurer que les bulles d'air sont éliminées. Les conditions de cyclage utilisées étaient les suivantes : 50 oc pendant 2 min et 95 oc pendant 10 min suivis de 45 cycles à 95 oc pendant 15 s et 60 oc pendant 1 min.

Des dilutions de quantités connues de souches de référence d'ADN ont été utilisées pour générer des courbes standard avec un coefficient de corrélation (R2 : 0,99). Pour la quantification/détermination du nombre de copies, les résultats des échantillons inconnus ont été projetés sur les courbes standard obtenues à partir des cultures pures en utilisant la formule : Quantité ADN = 10(ct-b)/m.

Détermination de l'interleukine-1, de l'interleukine-6, de l'adiponectine et du facteur de nécrose tumorale alpha dans le sérum.

Tous les réactifs ont été laissés atteindre la température ambiante avant utilisation et ont été mélangés doucement avant les expériences. Le nombre de barrettes de 8 puits nécessaires pour le test a été déterminé. 100 ul de tampon diluant standard ont été ajoutés aux puits zéro et 1 puits a été réservé pour le blanc de chromogène. 100 ul d'étalons, d'échantillons et de contrôles ont été ajoutés aux puits de microtitrage appropriés. 50 ul de solution anti-interleukine-6 ​​biotinylée (conjugué de biotine) ont été pipetés dans chaque puits à l'exception du blanc de chromagène, puis tapotés doucement sur le côté de la plaque pour mélanger. Ensuite, les plaques ont été recouvertes de couvre-plaques et incubées pendant 2 heures à température ambiante. Les solutions ont été soigneusement aspirées des puits et le liquide a été jeté. Les puits ont été lavés 4 fois. 100 ul de solution de travail de protéine riche en streptavidine-histidine ont été ajoutés à chaque puits à l'exception du blanc de chromogène. De nouveau, les plaques ont été recouvertes des couvercles de plaque et incubées pendant 30 minutes à température ambiante. La solution des puits a été soigneusement aspirée et le liquide jeté. Les puits ont été lavés 4 fois. 100 ul de chromogène stabilisé ont été ajoutés à chaque puits. Les plaques ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. 100 ul de solution d'arrêt ont été ajoutés à chaque puits puis tapotés doucement sur le côté de la plaque pour mélanger. L'absorbance de chaque puits a été lue à 450 nm après avoir isolé le lecteur de plaque contre un blanc de chromogène composé de 100 ul de chromogène stabilisé et de solution d'arrêt. L'absorbance des standards par rapport à la concentration standard a ensuite été tracée sur du papier millimétré.