Effekt av ikke-kirurgisk periodontal terapi verser orale hygieneinstruksjoner på pasienter med kronisk periodontitt

Personer med moderat til avansert kronisk periodontitt ble valgt ut for denne langsgående randomiserte kliniske studien. Etisk godkjenning for studien ble gitt av Medical Ethics Committee, Fakultet for odontologi, University of Malaya [Medical Ethics Committee Number: DF PE1002/0045(P)]. Studien ble utført i samsvar med Helsingfors-erklæringen fra 1975, som ble revidert i 2000. CONSORT-retningslinjene for kliniske studier ble fulgt.

Av 112 screenede pasienter oppfylte 56 pasienter inklusjons- og eksklusjonskriteriene. Inklusjonskriterier var minimum 12 tenner tilstede med lomme på 5 mm eller mer og sonderende festetap på 4 mm eller mer i minst 2 forskjellige kvadranter som blødde ved sondering. Eksklusjonskriterier inkluderer historie med kardiovaskulære problemer, graviditet, røykere og personer som har fått antibiotika de siste 4 månedene eller NSPT de siste 6 månedene. Rekrutterte pasienter ble behandlet ved periodontologiklinikken, Fakultet for odontologi, University of Malaya. Ved å bruke Cohens d-formel ble det beregnet at minst 26 pasienter ville være nødvendig per behandlingsgruppe for å oppdage denne forskjellen med 80 % kraft.

Før baselineundersøkelse ble pasientene tildelt NSPT- og OHI-gruppen ved bruk av blokkrandomisering. Pasienter i NSPT-gruppen fikk OHI, skalering og rotplaning etterfulgt av 0,12 % klorheksidin-munnskylling mens pasienter i OHI-gruppen kun fikk OHI. Ved hvert månedsbesøk ble deltakerne i begge gruppene gjennomgått og motivert. Profesjonell profylakse ble kun mottatt av NSPT-gruppen. To kalibrerte undersøkere (RPCR og WNAWA) utførte all behandling på pasientene. Probing lommedybde (PPD), sonderende festetap (PAL), gingival blødningsindeks (BI) og synlig plakkindeks (PI) ble bestemt på alle tilstedeværende tenner unntatt tredje molarer ved baseline og 3 måneder etter terapi. For PI og BI ble 4 steder målt (mesial, distal, bukkal, lingual) og for PPD og PAL ble 6 steder registrert (disto-bukkal, mid-bukkal, mesio-buckal, mesio-lingual, midlingual og disto- språklig). Ved å bruke Kappa-statistikk ble det oppnådd gode samsvar (>0,8) for intra- og interoperatør-reproduserbarhet av alle registrerte kliniske parametere.

Identifikasjon av subgingival mikrobiota ved bruk av kvantitativ polymerasekjedereaksjonsteknikk.

Sub-gingivale plakkskrapingsprøver ble tatt ved baseline og 3 måneder etter behandling med sterile kyretter fra de dypeste stedene i hver kvadrant og ble samlet sammen for hvert individ. Før prøvetaking ble isolasjonen opprettholdt med bomullsruller og supra-gingival plakk ble fjernet ved bruk av bomullspellets. Plakkskrap ble resuspendert i 1,5 ml fosfatbufret saltvann og lagret ved -80⁰C fryser før DNA-ekstraksjon. 100 µl plakkprøve ble brukt til automatisert DNA-ekstraksjon i laboratoriet ved bruk av Qiacube-maskinen (Qiagen®, Biotechnology, Nederland). Rørene som inneholdt plakkprøvene ble sentrifugert med en hastighet på 5000 x g i 10 minutter på en bordsentrifugemaskin for å oppnå pelleten. Pelleten ble deretter brukt til automatisert DNA-ekstraksjon med Qiacube-maskinen. 100 µl eluert DNA ble lagret i -20 ⁰C for bakteriell påvisning ved bruk av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (Applied Biosystem, USA).

Referansebakteriestammer brukt i denne studien var P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) og T.forsythia (CCUG 21028AT). Alle bakteriestammene ble dyrket som anbefalt av American Type Culture Collection (ATCC). Etter vekst av bakterier til sen eksponentiell fase ble de vasket med sterilt destillert vann og DNA-ekstraksjon ble utført ved bruk av samme protokoll som for plakkprøver.

Konsentrasjonen og renheten til ekstrahert DNA ble bestemt ved bruk av spektrofotometermaskin (Nanodrop 2000, Thermo scientific, USA). DNA-konsentrasjon fra både plakkprøver og referansestamme ble beregnet og registrert i henhold til dette. De ekstraherte DNA-ene ble lagret i -20°C inntil initiering av kvantitativ polymerasekjedereaksjonsprosedyre.

Protokollen gitt av Boutaga et al., (2005) ble fulgt for kvantitativ polymerasekjedereaksjon. Primere og prober valgt for denne studien er vist i tabell 1. En total reaksjonsblanding på 20 ul ble brukt for amplifikasjon, som inneholder 2 ul templat-DNA fra plakkprøve/referansestamme, 10 ul 2 x TaqMan fast advanced mastermix (Applied biosystems, USA), 1 ul 20x genekspresjonsanalyse og 7 ul nuklease gratis vann. Alle komponentene i reaksjonsblandingen bortsett fra DNA-prøven ble tilsatt i 1,5 ml mikrosentrifugerør. Røret ble vortexet og sentrifugert for å eliminere luftbobler. Blandingen ble overført til 96-brønners plate med tilsetning av 2 ul DNA-prøve. Platen ble deretter dekket med optisk klebemiddel og sentrifugert igjen for å sikre at luftbobler ble eliminert. Syklusforholdene som ble brukt var som følger: 50oc i 2 minutter og 95oc i 10 minutter etterfulgt av 45 sykluser ved 95oc i 15s og 60oc i 1 min.

Fortynninger av kjente mengder referansestammer av DNA ble brukt for å generere standardkurver med korrelasjonskoeffisient (R2: 0,99). For kvantifisering/kopinummerbestemmelse ble resultatene fra ukjente prøver projisert på standardkurvene oppnådd fra renkulturene ved bruk av formelen: Mengde DNA=10(ct-b)/m.

Bestemmelse av interleukin-1, interleukin-6, adiponectin og tumornekrosefaktor-alfa-nivå i serum.

Alle reagenser fikk nå romtemperatur før bruk og ble forsiktig blandet før forsøkene. Antall 8-brønners strimler nødvendig for analysen ble bestemt. 100 ul av standard fortynningsbuffer ble tilsatt til null brønner og 1 brønn ble reservert for kromogen-blank. 100 ul av standarder, prøver og kontroller ble tilsatt til de passende mikrotiterbrønnene. 50 ul biotinylert anti-interleukin-6 (biotinkonjugat)-løsning ble pipettert inn i hver brønn bortsett fra kromagenemnet og banket deretter forsiktig på siden av platen for å blande. Deretter ble platene dekket med platedeksler og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Løsninger ble grundig aspirert fra brønner og væsken kastet. Brønnene ble vasket 4 ganger. 100 ul streptavidin-histidin-rik proteinarbeidsløsning ble tilsatt til hver brønn bortsett fra kromogen-blindprøven. Igjen ble platene dekket med platedekslene og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Løsning fra brønner ble grundig aspirert og væsken kastet. Brønnene ble vasket 4 ganger. 100 ul stabilisert kromogen ble tilsatt til hver brønn. Platene ble inkubert i 30 minutter ved romtemperatur i mørke. 100 ul stoppløsning ble tilsatt til hver brønn og deretter banket forsiktig på siden av platen for å blande. Absorbansen til hver brønn ble avlest ved 450 nm etter å ha blanket plateavleseren mot et kromogentemne bestående av 100 ul hver av stabilisert kromogen og stoppløsning. Absorbansen av standardene mot standardkonsentrasjonen ble deretter plottet på millimeterpapir.