Ei-kirurgisen parodontaalihoidon vaikutus suuhygieniaohjeisiin potilaille, joilla on krooninen parodontiitti

Tähän pitkittäiseen satunnaistettuun kliiniseen tutkimukseen valittiin koehenkilöt, joilla oli kohtalainen tai pitkälle edennyt krooninen parodontiitti. Eettisen luvan tutkimukselle myönsi Malayan yliopiston hammaslääketieteellisen tiedekunnan lääketieteen eettinen komitea [Medical Ethics Committee Number: DF PE1002/0045(P)]. Tutkimus tehtiin Helsingin julistuksen 1975, sellaisena kuin se on tarkistettu vuonna 2000, mukaisesti. CONSORTin kliinisiä tutkimuksia koskevia ohjeita noudatettiin.

112 seulotusta potilaasta 56 potilasta täytti mukaanotto- ja poissulkemiskriteerit. Sisällyttämiskriteerit olivat vähintään 12 hammasta, joissa tasku oli 5 mm tai enemmän, ja mittauskiinnityshäviö 4 mm tai enemmän vähintään kahdessa eri neljänneksessä, jotka vuotivat verta mittauksen aikana. Poissulkemiskriteereihin kuuluivat sydän- ja verisuoniongelmat, raskaus, tupakoitsijat ja henkilöt, jotka ovat saaneet antibiootteja viimeisen 4 kuukauden aikana tai NSPT:tä viimeisen 6 kuukauden aikana. Rekrytoituja potilaita hoidettiin Malayan yliopiston hammaslääketieteellisen tiedekunnan parodontologian klinikalla. Cohenin d-kaavaa käyttäen laskettiin, että hoitoryhmää kohden tarvittaisiin vähintään 26 potilasta tämän eron havaitsemiseksi 80 % teholla.

Ennen perustutkimusta potilaat jaettiin NSPT- ja OHI-ryhmiin käyttämällä lohkosatunnaistusta. NSPT-ryhmän potilaat saivat OHI-hoitoa, hilseilyä ja juurien höyläystä, mitä seurasi 0,12 % klooriheksidiiniä sisältävä suuhuuhtelu, kun taas OHI-ryhmän potilaat saivat vain OHI-hoitoa. Jokaisella kuukausittaisella muistokäynnillä molempien ryhmien osallistujat arvioitiin ja motivoitiin. Ammattimaista profylaksia sai vain NSPT-ryhmä. Kaksi kalibroitua tutkijaa (RPCR ja WNAWA) suoritti kaiken hoidon potilaille. Kaikista nykyisistä hampaista paitsi kolmatta poskihampaasta määritettiin lähtötasolla ja 3 kuukautta hoidon jälkeen mittaustaskun syvyys (PPD), kiinnittymisen menetys (PAL), ienverenvuotoindeksi (BI) ja näkyvä plakkiindeksi (PI). PI:n ja BI:n osalta mitattiin 4 kohtaa (mesiaalinen, distaalinen, bukkaalinen, linguaalinen) ja PPD:lle ja PAL:lle 6 kohtaa (disto-bukkaalinen, mid-buccal, mesio-buccal, mesio-lingual, mid-lingual and disto- kielellinen). Kappa-tilastoja hyödyntäen saatiin hyvät sopimukset (>0,8) kaikkien tallennettujen kliinisten parametrien toistettavuudesta operaattorien sisällä ja toisten välillä.

Subgingivaalisen mikrobiotan tunnistaminen kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiotekniikalla.

Subgingivaalisen plakin raapimisnäytteet otettiin lähtötilanteessa ja 3 kuukautta hoidon jälkeen steriileillä kyreteillä kunkin kvadrantin syvimmistä kohdista, ja ne yhdistettiin kullekin koehenkilölle. Ennen näytteenottoa eristettiin puuvillarullilla ja supra-gingivaalinen plakki poistettiin puuvillapelleteillä. Plakkikaapinnot suspendoitiin uudelleen 1,5 ml:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja säilytettiin -80 °C:ssa pakastimessa ennen DNA:n uuttamista. 100 ui plakkinäytettä käytettiin automatisoituun DNA:n uuttamiseen laboratoriossa käyttämällä Qiacube-konetta (Qiagen®, Biotechnology, Alankomaat). Plakkinäytteet sisältävät putket sentrifugoitiin nopeudella 5 000 x g 10 minuuttia pöytäsentrifugikoneessa pelletin saamiseksi. Pellettiä käytettiin sitten automaattiseen DNA-uuttoon Qiacube-koneella. 100 ui eluoitua DNA:ta säilytettiin -20 °C:ssa bakteerien havaitsemiseksi käyttämällä kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota (Applied Biosystem, USA).

Tässä tutkimuksessa käytetyt vertailubakteerikannat olivat P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) ja T.forsythia (CCUG 21028AT). Kaikkia bakteerikantoja kasvatettiin American Type Culture Collectionin (ATCC) suosittelemalla tavalla. Bakteerien kasvun jälkeen myöhäiseen eksponentiaaliseen vaiheeseen ne pestiin steriilillä tislatulla vedellä ja DNA-uutto suoritettiin käyttäen samaa protokollaa kuin plakkinäytteille.

Uutetun DNA:n pitoisuus ja puhtaus määritettiin spektrofotometrikoneella (Nanodrop 2000, Thermo science, USA). DNA-konsentraatio sekä plakkinäytteistä että vertailukannasta laskettiin ja rekisteröitiin vastaavasti. Uutetut DNA:t säilytettiin -20 °C:ssa kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktiomenettelyn aloittamiseen asti.

Boutaga et ai., (2005) antamaa protokollaa noudatettiin kvantitatiivisessa polymeraasiketjureaktiossa. Tähän tutkimukseen valitut alukkeet ja koettimet on esitetty taulukossa 1. Monistukseen käytettiin 20 ul:n kokonaisreaktioseosta, joka sisältää 2 ul templaatti-DNA:ta plakkinäytteestä/vertailukannasta, 10 ul 2 x TaqMan fast Advanced master -seosta (Applied biosystems, USA), 1 ul 20x geeniekspressiomääritystä ja 7 ul nukleaasia. ilmaista vettä. Kaikki reaktioseoksen komponentit paitsi DNA-näytettä lisättiin 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkeen. Putkea vorteksoitiin ja sen jälkeen sentrifugoitiin ilmakuplien poistamiseksi. Seos siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle lisäämällä 2 ui DNA-näytettä. Levy peitettiin sitten optisella liimalla ja sentrifugoitiin uudelleen sen varmistamiseksi, että ilmakuplat poistuvat. Käytetyt sykliolosuhteet olivat seuraavat: 50 oc 2 min ja 95 o 10 min, mitä seurasi 45 sykliä 95 o 15 s ja 60 o 1 min.

Tunnettujen määrien DNA-vertailukantojen laimennoksia käytettiin luomaan standardikäyriä korrelaatiokertoimella (R2: 0,99). Kvantitointia/kopiomäärän määritystä varten tulokset tuntemattomista näytteistä projisoitiin standardikäyriin, jotka saatiin puhtaista viljelmistä käyttämällä kaavaa: DNA:n määrä = 10(ct-b)/m.

Interleukiini-1-, interleukiini-6-, adiponektiini- ja tuumorinekroositekijä-alfa-tason määritys seerumissa.

Kaikkien reagenssien annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ennen käyttöä, ja niitä sekoitettiin varovasti ennen kokeita. Määritettiin tarvittavien 8-kuoppaisten liuskojen lukumäärä. 100 ui standardilaimennuspuskuria lisättiin nollakuoppaan ja 1 kuoppa varattiin kromogeenin nollakokeeseen. 100 ui standardeja, näytteitä ja kontrolleja lisättiin asianmukaisiin mikrotiitterikuoppiin. 50 ui biotinyloitua anti-interleukiini-6-liuosta (Biotiinikonjugaatti) pipetoitiin kuhunkin kuoppaan paitsi kromageenin nollakoekappaleeseen ja sitten koputettiin varovasti levyn kylkeen sekoittamiseksi. Seuraavaksi levyt peitettiin levyjen kansilla ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Liuokset aspiroitiin perusteellisesti kuopista ja neste heitettiin pois. Kuopat pestiin 4 kertaa. 100 ui streptavidiinia ja histidiiniä sisältävää runsaasti proteiinia sisältävää työliuosta lisättiin jokaiseen kuoppaan lukuun ottamatta kromogeenin nollakoetta. Jälleen levyt peitettiin levyjen kansilla ja niitä inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Liuos kuopista imettiin perusteellisesti ja neste heitettiin pois. Kuopat pestiin 4 kertaa. 100 ui stabiloitua kromogeenia lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa pimeässä. 100 ul pysäytysliuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sitten koputettiin varovasti levyn kylkeen sekoittamiseksi. Kunkin kuopan absorbanssi luettiin aallonpituudella 450 nm, kun levynlukija oli tyhjennetty kromogeenin nollakoetta vastaan, joka koostui kutakin 100 ul:sta stabiloitua kromogeenia ja pysäytysliuosta. Standardien absorbanssi standardipitoisuutta vastaan ​​piirrettiin sitten graafiselle paperille.