Effekt av icke-kirurgisk parodontitterapi verser orala hygieninstruktioner på patienter med kronisk parodontit

Försökspersoner med måttlig till avancerad kronisk parodontit valdes ut för denna longitudinella randomiserade kliniska prövning. Etiskt godkännande för studien beviljades av den medicinska etiska kommittén, fakulteten för odontologi, University of Malaya [Medical Ethics Committee Number: DF PE1002/0045(P)]. Studien genomfördes i enlighet med Helsingforsdeklarationen från 1975, som reviderades år 2000. CONSORT:s riktlinjer för kliniska prövningar följdes.

Av 112 screenade patienter uppfyllde 56 patienter inklusions- och exkluderingskriterierna. Inklusionskriterierna var minst 12 tänder närvarande med ficka på 5 mm eller mer och sonderingsförlust på 4 mm eller mer i minst 2 olika kvadranter som blödde vid sondering. Uteslutningskriterier inkluderade tidigare kardiovaskulära problem, graviditet, rökare och försökspersoner som fått antibiotika under de senaste 4 månaderna eller NSPT under de senaste 6 månaderna. Rekryterade patienter behandlades på parodontologiska kliniken, fakulteten för odontologi, University of Malaya. Med hjälp av Cohens d-formel beräknades att minst 26 patienter skulle behövas per behandlingsgrupp för att upptäcka denna skillnad med 80 % kraft.

Före baslinjeundersökningen tilldelades patienterna NSPT- och OHI-gruppen med hjälp av blockrandomisering. Patienter i NSPT-gruppen fick OHI, fjällning och rothyvling följt av 0,12 % klorhexidin-munsköljning medan patienter i OHI-gruppen endast fick OHI. Vid varje månadsbesök granskades och motiverades deltagarna i båda grupperna. Professionell profylax mottogs endast av NSPT-gruppen. Två kalibrerade granskare (RPCR och WNAWA) utförde all behandling på patienterna. Probing fickdjup (PPD), sondering fäste förlust (PAL), gingival blödning index (BI) och synligt plack index (PI) bestämdes på alla närvarande tänder utom tredje molarerna vid baslinjen och 3 månader efter behandlingen. För PI och BI mättes 4 ställen (mesial, distal, buckal, lingual) och för PPD och PAL registrerades 6 ställen (disto-buckal, mid-buckal, mesio-buckal, mesio-lingual, mid-lingual och disto- språklig). Genom att använda Kappa-statistik erhölls goda överensstämmelser (>0,8) för reproducerbarhet inom och mellan operatörer av alla registrerade kliniska parametrar.

Identifiering av subgingival mikrobiota med hjälp av kvantitativ polymeraskedjereaktionsteknik.

Sub-gingivala plackskrapprov erhölls vid baslinjen och 3 månader efter behandling med sterila kyretter från de djupaste platserna vid varje kvadrant och slogs samman för varje individ. Före provtagningen upprätthölls isoleringen med bomullsrullar och supra-gingival plack avlägsnades med användning av bomullspellets. Plackskrapningar återsuspenderades i 1,5 ml fosfatbuffrad koksaltlösning och lagrades vid -80°C frys innan DNA-extraktion. 100 µl plackprov användes för automatiserad DNA-extraktion i labbet med hjälp av Qiacube-maskinen (Qiagen®, Biotechnology, Nederländerna). Rören innehållande plackproverna centrifugerades med en hastighet av 5 000 x g under 10 minuter på en bordscentrifug för att erhålla pelleten. Pelleten användes sedan för automatiserad DNA-extraktion med Qiacube-maskinen. 100 µl eluerat DNA lagrades i -20°C för bakteriell detektion med användning av kvantitativ polymeraskedjereaktion (Applied Biosystem, USA).

Referensbakteriestammar som användes i denna studie var P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) och T.forsythia (CCUG 21028AT). Alla bakteriestammarna odlades enligt rekommendationerna av American Type Culture Collection (ATCC). Efter tillväxten av bakterier till sen exponentiell fas tvättades de med sterilt destillerat vatten och DNA-extraktion utfördes med användning av samma protokoll som för plackprover.

Koncentrationen och renheten av extraherat DNA bestämdes med användning av en spektrofotometermaskin (Nanodrop 2000, Thermo scientific, USA). DNA-koncentrationen från både plackprover och referensstam beräknades och registrerades i enlighet med detta. De extraherade DNA:n lagrades i -20°C tills initieringen av kvantitativ polymeraskedjereaktionsprocedur.

Protokollet som ges av Boutaga et al., (2005) följdes för kvantitativ polymeraskedjereaktion. Primers och prober som valts ut för denna studie visas i tabell 1. En total reaktionsblandning på 20 ul användes för amplifiering, som innehåller 2 ul mall-DNA från plackprov/referensstam, 10 ul 2 x TaqMan snabb avancerad mastermix (Applied biosystems, USA), 1 ul 20x genuttrycksanalys och 7 ul nukleas Gratis vatten. Alla komponenterna i reaktionsblandningen förutom DNA-provet tillsattes i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Röret vortexades och centrifugerades sedan för att eliminera luftbubblor. Blandningen överfördes till 96-brunnars platta med tillsats av 2 ul DNA-prov. Plattan täcktes sedan med optiskt lim och centrifugerades igen för att säkerställa att luftbubblor eliminerades. Cykelförhållandena som användes var följande: 50 oC i 2 min och 95 oC i 10 min följt av 45 cykler vid 95 oC i 15 s och 60 oC i 1 min.

Spädningar av kända mängder av referensstammar av DNA användes för att generera standardkurvor med korrelationskoefficient (R2: 0,99). För bestämning av kvantifiering/kopiatal projicerades resultaten från okända prover på standardkurvorna erhållna från de rena kulturerna med användning av formeln: Kvantitet DNA=10(ct-b)/m.

Bestämning av interleukin-1, interleukin-6, adiponectin och tumörnekrosfaktor-alfanivå i serum.

Alla reagenser fick nå rumstemperatur före användning och blandades försiktigt före experimenten. Antalet 8-brunnars remsor som behövdes för analysen bestämdes. 100 ul av standardutspädningsbufferten sattes till noll brunnar och 1 brunn reserverades för kromogenblank. 100 ul av standarder, prover och kontroller sattes till lämpliga mikrotiterbrunnar. 50 ul av biotinylerad anti-interleukin-6-lösning (biotinkonjugat) pipetterades i varje brunn förutom kromagenblanket och knackade sedan försiktigt på sidan av plattan för att blandas. Därefter täcktes plattorna med plattöverdrag och inkuberades i 2 timmar vid rumstemperatur. Lösningar aspirerades grundligt från brunnar och vätskan kasserades. Brunnarna tvättades 4 gånger. 100 ul streptavidin-histidin-rik proteinarbetslösning sattes till varje brunn utom kromogenblanket. Återigen täcktes plattorna med plattöverdragen och inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur. Lösning från brunnar aspirerades grundligt och vätskan kasserades. Brunnarna tvättades 4 gånger. 100 ul stabiliserad kromogen sattes till varje brunn. Plattorna inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur i mörker. 100 ul stopplösning sattes till varje brunn och knackade sedan försiktigt på sidan av plattan för att blandas. Absorbansen för varje brunn avlästes vid 450 nm efter att plattläsaren blankts mot ett kromogenämne bestående av 100 ul vardera av stabiliserad kromogen och stopplösning. Absorbansen av standarderna mot standardkoncentrationen plottades sedan på diagrampapper.