만성 치주염 환자에 대한 비수술적 치주 치료와 구강 위생 지침의 효과

중등도 내지 진행성 만성 치주염을 앓는 피험자가 이 종단 무작위 임상 시험을 위해 선택되었습니다. 이 연구에 대한 윤리적 허가는 말라야 대학교 치과학부의 의료 윤리 위원회[의료 윤리 위원회 번호: DF PE1002/0045(P)]에 의해 승인되었습니다. 이 연구는 2000년에 개정된 1975년 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 임상 시험에 대한 CONSORT 지침을 따랐습니다.

선별된 112명의 환자 중 56명의 환자가 포함 및 제외 기준을 충족했습니다. 포함 기준은 5mm 이상의 포켓이 있는 최소 12개의 치아와 프로빙에서 출혈이 있는 최소 2개의 다른 사분면에서 4mm 이상의 프로빙 부착물 손실이었습니다. 제외 기준에는 심혈관 문제의 병력, 임신, 흡연자 및 지난 4개월 동안 항생제를 투여받은 피험자 또는 지난 6개월 동안 NSPT가 포함되었습니다. 모집된 환자는 말라야 대학교 치의학부 치주과 클리닉에서 치료를 받았습니다. Cohen의 d 공식을 사용하여 80% 검정력으로 이 차이를 감지하려면 치료 그룹당 최소 26명의 환자가 필요하다고 계산되었습니다.

기준선 검사 전에 환자는 블록 무작위화를 사용하여 NSPT 및 OHI 그룹에 할당되었습니다. NSPT 그룹의 환자는 OHI, 스케일링 및 치근 활택술을 받은 후 0.12% 클로르헥시딘 양치질을 받은 반면 OHI 그룹의 환자는 OHI만 받았습니다. 매월 회상 방문에서 두 그룹의 참가자를 검토하고 동기를 부여했습니다. 전문적인 예방은 NSPT 그룹에서만 받았습니다. 두 명의 보정된 검사자(RPCR 및 WNAWA)가 환자에 대한 모든 치료를 수행했습니다. Probing pocket depth(PPD), probing attachment loss(PAL), 치은출혈지수(BI), 가시성 치태지수(visible plaque index, PI)는 베이스라인과 치료 3개월 후 제3대구치를 제외한 현재의 모든 치아에 대해 결정되었다. PI 및 BI의 경우 4개 부위(근심, 원위, 협측, 설측)를 측정하고 PPD 및 PAL의 경우 6개 부위(구위 협측, 중앙 협측, 근심 협측, 근심설측, 중간 설측 및 원위 협측)을 기록했습니다. 언어). Kappa 통계를 활용하여 기록된 모든 임상 매개변수의 작업자 내 및 작업자 간 재현성에 대해 좋은 일치(>0.8)를 얻었습니다.

정량적 중합효소 연쇄반응 기법을 이용한 치은연하 미생물의 동정

치은연하 플라크 스크래핑 샘플은 각 사분면의 가장 깊은 부위에서 무균 큐렛으로 기준선 및 치료 후 3개월에 얻었고 각 피험자에 대해 함께 모였습니다. 샘플링 전에 면봉으로 격리를 유지하고 면 펠릿을 사용하여 치은 상 플라크를 제거했습니다. 플라크 스크래핑을 1.5ml의 인산염 완충 식염수에 재현탁하고 DNA 추출 전에 -80⁰C 냉동고에 보관했습니다. 100µl의 플라크 샘플을 Qiacube 기계(Qiagen®, Biotechnology, 네덜란드)를 사용하여 실험실에서 자동 DNA 추출에 사용했습니다. 플라크 샘플이 담긴 튜브를 테이블탑 원심분리기에서 10분 동안 5,000 x g의 속도로 원심분리하여 펠릿을 얻었다. 그런 다음 펠릿을 Qiacube 기계로 자동화된 DNA 추출에 사용했습니다. 100µl의 용출된 DNA는 정량 중합효소 연쇄 반응(Applied Biosystem, USA)을 사용하여 박테리아 검출을 위해 -20⁰C에 보관되었습니다.

이 연구에 사용된 참조 박테리아 균주는 P.gingivalis(W83), A.actinomycetemcomitans(NCTC9710), P.intermedia(ATCC25611) 및 T.forsythia(CCUG 21028AT)였습니다. 모든 박테리아 균주는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 권장하는 대로 성장했습니다. 후기 지수기까지 박테리아의 성장 후 멸균 증류수로 세척하고 플라크 샘플과 동일한 프로토콜을 사용하여 DNA 추출을 수행했습니다.

추출된 DNA의 농도와 순도는 분광광도계(Nanodrop 2000, Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정하였다. 플라크 샘플과 기준 균주의 DNA 농도를 계산하고 그에 따라 기록했습니다. 추출된 DNA는 정량 중합효소연쇄반응 과정이 시작될 때까지 -20⁰C에 보관하였다.

정량적 폴리머라제 연쇄 반응은 Boutaga et al., (2005)에 의해 제공된 프로토콜을 따랐다. 이 연구를 위해 선택된 프라이머와 프로브는 표 1에 나와 있습니다. 20ul의 총 반응 혼합물을 증폭에 사용했으며, 여기에는 플라크 샘플/기준 균주의 주형 DNA 2ul, 2 x TaqMan fast advanced master mix(Applied biosystems, USA) 10ul, 20x 유전자 발현 분석 1ul 및 7ul 뉴클레아제가 포함됩니다. 무료 물. DNA 샘플을 제외한 반응 혼합물의 모든 성분을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣었다. 튜브를 볼텍싱하고 원심분리하여 기포를 제거했습니다. 혼합물을 2ul DNA 샘플을 첨가하여 96-웰 플레이트로 옮겼다. 그런 다음 플레이트를 광학 접착제로 덮고 다시 원심분리하여 기포가 제거되었는지 확인했습니다. 사용된 순환 조건은 다음과 같습니다: 50oc에서 2분, 95oc에서 10분, 이어서 95oc에서 15초, 60oc에서 1분 동안 45주기.

알려진 양의 DNA 참조 균주의 희석액을 사용하여 상관 계수(R2: 0.99)를 갖는 표준 곡선을 생성했습니다. 정량화/카피 수 결정을 위해 미지 시료의 결과를 다음 공식을 사용하여 순수 배양물에서 얻은 표준 곡선에 투영했습니다. DNA 수량=10(ct-b)/m.

혈청 내 Interleukin-1, Interleukin-6, Adiponectin 및 종양 괴사 인자-알파 수준의 결정.

모든 시약은 사용하기 전에 실온에 도달하도록 하고 실험 전에 부드럽게 혼합했습니다. 분석에 필요한 8웰 스트립의 수를 결정했습니다. 100 ul의 표준 희석 완충액을 0개의 웰에 첨가하고 1개의 웰은 크로모겐 블랭크용으로 남겨두었습니다. 100ul의 표준물질, 샘플 및 대조군을 적절한 마이크로타이터 웰에 첨가했습니다. 50 ul의 biotinylated anti-Interleukin-6 (Biotin Conjugate) 용액을 크로마겐 블랭크를 제외한 각 웰에 피펫팅한 다음 플레이트 측면을 가볍게 두드려 혼합했습니다. 다음으로, 플레이트를 플레이트 커버로 덮고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 용액을 웰에서 완전히 흡인하고 액체를 버렸다. 웰을 4회 세척하였다. 100ul 스트렙타비딘-히스티딘-풍부 단백질 작업 용액을 크로모겐 블랭크를 제외한 각 웰에 첨가했습니다. 다시, 플레이트를 플레이트 커버로 덮고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 웰의 용액을 완전히 흡인하고 액체를 버렸다. 웰을 4회 세척하였다. 100ul의 Stabilized Chromogen을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온의 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 100 ul의 정지 용액을 각 웰에 첨가한 다음 플레이트 측면을 가볍게 두드려 혼합했습니다. 각각의 웰의 흡광도는 각각 100ul의 Stabilized Chromogen 및 Stop Solution으로 구성된 chromogen 블랭크에 대해 플레이트 판독기를 블랭킹한 후 450nm에서 판독되었습니다. 그런 다음 표준 농도에 대한 표준의 흡광도를 그래프 용지에 표시했습니다.