Влияние нехирургической пародонтальной терапии в сочетании с инструкциями по гигиене полости рта у пациентов с хроническим пародонтитом

Для этого продольного рандомизированного клинического исследования были отобраны субъекты с хроническим пародонтитом от умеренной до тяжелой степени. Этическое разрешение на исследование было предоставлено Комитетом по медицинской этике стоматологического факультета Университета Малайи [Номер комитета по медицинской этике: DF PE1002/0045(P)]. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией 1975 г., пересмотренной в 2000 г. Руководящие принципы CONSORT для клинических испытаний были соблюдены.

Из 112 пациентов, прошедших скрининг, 56 пациентов соответствовали критериям включения и исключения. Критерии включения: наличие минимум 12 зубов с карманом 5 мм или более и потеря прикрепления при зондировании 4 мм или более как минимум в 2 разных квадрантах, кровоточащих при зондировании. Критерии исключения включали сердечно-сосудистые заболевания в анамнезе, беременность, курение и субъекты, получавшие антибиотики в течение последних 4 месяцев или NSPT в течение последних 6 месяцев. Набранные пациенты проходили лечение в пародонтологической клинике стоматологического факультета Малайского университета. Используя формулу Коэна d, было подсчитано, что для выявления этой разницы с мощностью 80% потребуется не менее 26 пациентов в группе лечения.

Перед базовым обследованием пациенты были распределены в группы NSPT и OHI с помощью блочной рандомизации. Пациенты в группе NSPT получали OHI, скейлинг и полировку корней с последующим полосканием рта 0,12% хлоргексидином, в то время как пациенты в группе OHI получали только OHI. Во время каждого ежемесячного повторного визита участников обеих групп оценивали и мотивировали. Профессиональную профилактику получила только группа НСПТ. Два квалифицированных специалиста (RPCR и WNAWA) выполняли все лечение пациентов. Глубина кармана при зондировании (PPD), потеря прикрепления при зондировании (PAL), индекс кровоточивости десен (BI) и индекс видимого зубного налета (PI) определялись на всех имеющихся зубах, кроме третьих моляров, в начале исследования и через 3 месяца после лечения. Для PI и BI были измерены 4 точки (мезиальная, дистальная, щечная, язычная), а для PPD и PAL были зарегистрированы 6 точек (дистощечная, среднещечная, мезиощечная, мезиолингвальная, среднеязычная и дисто-щечная). языковой). Используя статистику Каппа, были получены хорошие совпадения (> 0,8) для воспроизводимости внутри и между операторами всех зарегистрированных клинических параметров.

Идентификация поддесневой микробиоты с помощью количественного метода полимеразной цепной реакции.

Образцы соскоба поддесневого зубного налета были получены на исходном уровне и через 3 месяца после терапии стерильными кюретками из самых глубоких участков в каждом квадранте и объединены для каждого субъекта. Перед взятием проб изоляцию поддерживали ватными тампонами, а наддесневой налет удаляли ватными тампонами. Соскобы зубного налета ресуспендировали в 1,5 мл фосфатно-солевого буфера и хранили в морозильной камере при температуре -80°C до экстракции ДНК. 100 мкл образца зубного налета использовали для автоматической экстракции ДНК в лаборатории с использованием машины Qiacube (Qiagen®, Biotechnology, Нидерланды). Пробирки, содержащие образцы зубного налета, центрифугировали при скорости 5000 g в течение 10 минут на настольной центрифуге для получения осадка. Затем осадок использовали для автоматической экстракции ДНК с помощью машины Qiacube. 100 мкл элюированной ДНК хранили при -20⁰C для обнаружения бактерий с помощью количественной полимеразной цепной реакции (Applied Biosystem, США).

Эталонными бактериальными штаммами, использованными в этом исследовании, были P.gingivalis (W83), A.actinomycetemcomitans (NCTC9710), P.intermedia (ATCC25611) и T.forsythia (CCUG 21028AT). Все бактериальные штаммы выращивали в соответствии с рекомендациями Американской коллекции типовых культур (ATCC). После роста бактерий до поздней экспоненциальной фазы их промывали стерильной дистиллированной водой и проводили экстракцию ДНК по тому же протоколу, что и для образцов бляшек.

Концентрацию и чистоту выделенной ДНК определяли с помощью спектрофотометра (Nanodrop 2000, Thermo Scientific, США). Концентрация ДНК как в образцах бляшек, так и в эталонном штамме рассчитывалась и записывалась соответствующим образом. Экстрагированные ДНК хранили при -20⁰C до начала процедуры количественной полимеразной цепной реакции.

Протокол, данный Boutaga et al. (2005), был использован для количественной полимеразной цепной реакции. Праймеры и зонды, выбранные для этого исследования, показаны в таблице 1. Для амплификации использовали общую реакционную смесь объемом 20 мкл, которая содержит 2 мкл матричной ДНК из образца бляшки/эталонного штамма, 10 мкл 2 х TaqMan fast advanced master mix (Applied biosystems, США), 1 мкл 20х анализа экспрессии генов и 7 мкл нуклеазы. бесплатная вода. Все компоненты реакционной смеси, кроме образца ДНК, добавляли в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Пробирку встряхивали, а затем центрифугировали для удаления пузырьков воздуха. Смесь переносили в 96-луночный планшет с добавлением 2 мкл образца ДНК. Затем планшет покрывали оптическим клеем и снова центрифугировали, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха удалены. Используемые условия циклирования были следующими: 50°С в течение 2 мин и 95°С в течение 10 мин, затем 45 циклов при 95°С в течение 15 с и 60°С в течение 1 мин.

Разведения известных количеств эталонных штаммов ДНК использовали для построения стандартных кривых с коэффициентом корреляции (R2: 0,99). Для количественного определения/определения количества копий результаты для неизвестных образцов проецировали на стандартные кривые, полученные для чистых культур, по формуле: Количество ДНК=10(ct-b)/m.

Определение уровня интерлейкина-1, интерлейкина-6, адипонектина и фактора некроза опухоли-альфа в сыворотке.

Всем реагентам давали возможность достичь комнатной температуры перед использованием и осторожно перемешивали перед экспериментами. Определяли количество 8-луночных стрипов, необходимых для анализа. 100 мкл стандартного буфера для разбавления добавляли в нулевые лунки, а 1 лунку оставляли для холостой пробы с хромогеном. 100 мкл стандартов, образцов и контролей добавляли в соответствующие лунки микротитратора. 50 мкл раствора биотинилированного анти-интерлейкина-6 (биотинового конъюгата) пипеткой вносили в каждую лунку, кроме хромагеновой холостой пробы, а затем осторожно постукивали по краю планшета для перемешивания. Затем планшеты накрывали крышками для планшетов и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Растворы тщательно отсасывали из лунок, а жидкость отбрасывали. Лунки промывали 4 раза. 100 мкл рабочего раствора белка, богатого стрептавидином и гистидином, добавляли в каждую лунку, кроме контрольного хромогена. Планшеты снова накрывали крышками для планшетов и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Раствор из лунок тщательно отсасывали, а жидкость отбрасывали. Лунки промывали 4 раза. В каждую лунку добавляли 100 мкл стабилизированного хромогена. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. В каждую лунку добавляли 100 мкл стоп-раствора, а затем осторожно постукивали по краю планшета для перемешивания. Поглощение каждой лунки считывали при 450 нм, отключив планшет-ридер от холостой пробы с хромогеном, состоящей из 100 мкл каждого из стабилизированного хромогена и стоп-раствора. Затем на графическую бумагу наносили поглощение стандартов в зависимости от стандартной концентрации.