Miswak 咀嚼棒对口腔幽门螺杆菌感染的影响 (Miswak)

伦理方面实验方案经科威特大学健康科学中心 (HSC) 伦理委员会 (VDR/ED/3331) 批准，并在 ClinicalTrials.gov 注册为 NCT02418520 (16/04/2015)。 研究是根据赫尔辛基人体医学实验宣言中概述的原则进行的。 所有参与者都获得了书面知情同意书，并根据报告试验的综合标准 (CONSORT) 指南提出。

研究设计 这是一项随机、交叉、单盲设计的实验研究。

研究样本和数据收集 这项研究是在科威特科威特大学牙科中心就诊的普通患者中进行的。 患者招募于 2 月开始，并于 2019 年 8 月底完成。 本研究的 PICO（P = 患者群体；I = 感兴趣的干预；C = 比较干预；O = 结果）问题是，“对于处于不同禁食条件 (P) 下的受试者，使用 miswak 咀嚼棒的效果是什么使用牙刷 (I) 与仅使用牙刷 (C) 对口腔幽门螺杆菌计数 (O) 的影响？”。 向志愿者患者简要介绍了研究的组成部分，并获得了他们的知情同意。 收集唾液和斑块样本进​​行 PCR 筛查，以检测是否存在幽门螺杆菌。 纳入标准是：1) 在斑块或唾液样本中具有可检测水平的幽门螺杆菌的受试者； 2) 无牙周炎证据；以及，3) 至少有 24 颗牙齿。 在过去三个月内接受抗生素治疗或质子泵抑制剂的受试者被排除在研究之外。

研究参与者的招募和分组 本研究包括 20 名禁食 12 小时的受试者（禁食组）和 20 名未禁食的受试者（非禁食组）。 非禁食组受试者在 2 月至 4 月期间招募，禁食组受试者在 2018 年 5 月至 6 月（斋月）期间招募。 在基线 (T0)，每个受试者都根据参与研究的时间顺序分配了编号。 禁食和非禁食受试者都被随机分为第 1 组和第 2 组（每组 n = 10）。 受试者的随机分配是通过骰子的随机二元结果进行的，偶数或奇数。 考官不知道参与者的分配。 第 1 组受试者被指示使用牙刷和 miswak (TB+M) 两周 (T1)，并在接下来的两周 (T2) 仅使用牙刷 (TB)；并且，对于禁食组和非禁食组，第 2 组受试者被要求在 T1 期间仅使用 TB，在 T2 期间仅使用 TB+M。 一位调查员 (JKB) 向参与者提供了如何使用 miswak（五指抓握，擦洗技术，15 分钟，每天两次 21）和 TB（改进的 Bass 技术，两分钟，每天两次）的说明。 在 T0、T1 和 T2 收集斑块和唾液样本。

问卷 对受试者进行访谈并收集有关其社会人口特征（年龄、性别、教育、就业和收入）、特定医疗状况（高血压、糖尿病和当前药物治疗）、吸烟状况和牙齿特征（每日刷牙频率）的信息和以前的牙科访问）。

临床检查 在基线 (T0)，三名经过培训和校准的检查员使用口镜和手动牙周探针（CP11 Hu Friedy，欧洲）进行临床检查，患者半仰卧在牙科椅上（A-dec ，纽伯格，俄勒冈州，美国）。 临床检查评估了 Silness & Löe 牙菌斑指数 (PI)、Löe & Silness 牙龈指数 (GI)、临床附着丧失 (CAL)、探诊深度 (PD) 和探诊出血 (BOP)（内部/内部）考官可靠性 >80%)。 这些测量是在所有牙齿的六个表面（中舌/腭、远舌/腭、近中舌/腭、远颊、中颊和近颊）上进行的。 记录缺失牙齿的数量。

样本采集程序 在 T0、T1 和 T2 从受试者采集斑块和唾液样本。 在最深的口袋读数时从牙龈缝中取出牙菌斑样品，并使用无菌通用刮匙从临床部位取出。 使用唾液喷射器隔离取样区域，并轻轻风干。 将刮匙的尖端插入缝隙/袋的深处，在与牙齿表面接触的同时沿冠状方向移动，以去除龈下和龈上菌斑。 然后将样品浸入 Eppendorf 管（epTIPS Standard，Eppendorf AG，Hamburg，Germany）中的 0.5 ml 无菌蒸馏水中。 为了收集刺激唾液样本，受试者被要求咀嚼石蜡并吐出到与分级量筒相连的塑料漏斗中。 从每个受试者身上收集了大约 3 毫升的唾液。 采集完成后立即将样品管放入装满碎冰的容器中，运送至口腔微生物实验室-800℃保存。

细菌培养幽门螺杆菌JA1菌株获自科威特大学医学院。 细菌菌株在微需氧条件下于 37 摄氏度下在补充有脱纤维羊血 (5%) 的胰蛋白酶大豆琼脂上生长。

DNA 纯化 唾液和噬菌斑样本在冰上被带到实验室。 在 12000 × g 下涡旋 1 分钟后，去除上清液，并将沉淀物储存在 -80°C 下。 根据制造商的说明，使用 DNeasy DNA 纯化试剂盒（Qiagen，德国）纯化沉淀物中的 DNA。 简而言之，将沉淀物用裂解缓冲液和蛋白酶-K 在 56 摄氏度下处理 1 小时。 将来自裂解样品的 DNA 应用到旋转柱上并洗涤。 使用无核酸酶水洗脱纯化的 DNA，并使用 NanoDropTM 1000 通过紫外分光光度法测量 DNA 浓度。 使用相同的方法纯化幽门螺杆菌 JA1 的基因组 DNA。

定量实时聚合酶链反应 (qPCR) 从样品中纯化 DNA 后，使用幽门螺杆菌物种特异性 ureA 基因引物：ureA-F，通过 SYBR Green 定量实时 PCR 方法测量幽门螺杆菌的数量：5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' 和 ureA-R：5'- GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44。 qPCR 反应混合物 (25 µl) 包含 12.5 µl SYBR Green 预混液（Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems）、正向和反向引物各 1.0 µl (0.4 µM)、5.0 µl DNA 模板和 5.5 µl H2O。 热曲线如下：95℃初始变性10分钟，40个95℃15-30s、55℃30s和72℃30s的循环。 荧光信号采集设置在每个循环的延伸步骤。 所有 qPCR 反应均在 ABpplied Biosystems® Fast 7500 实时 PCR 仪上运行。 序列检测系统 (SDS)（软件版本 2.3）用于数据分析。 来自幽门螺杆菌 JA1 的连续稀释的基因组 DNA 用于绘制 Ct 值对每个物种的推导细菌细胞浓度（细胞/mL）的反应，并使用上述软件构建标准曲线。 对于样品、标准品和对照品，一式三份进行所有测量。

数据管理和统计分析 在不同禁食条件下使用 TB+M 或 TB 减少幽门螺杆菌计数是本研究感兴趣的主要结果。 由于没有关于 miswak 对 H. pylori 影响的先验信息，因此计算样本量以检测组间 50% 的差异，假设组间 H. pylori 计数平均减少 30%，标准差为的 15%。 为了获得 80% 的功效和 0.05 的风险 alpha，每组需要 17 名患者，四舍五入为 20 名，以说明任何潜在的退出。 在 T0、T1 和 T2 之间计算微生物计数的差异。 使用 Mann-Whitney U 检验或 Kruskal-Wallis 检验（连续因变量）和卡方检验（分类因变量）来评估两组之间一般特征的差异。 使用 Kolmogorov-Smirnov 和 Shapiro-Wilk 测试探索各组之间幽门螺杆菌的分布是否正常。 数据不是正态分布的，因此使用 Wilcoxon 符号秩检验评估 H. pylori 计数的组内变化，并使用 Mann-Whitney U 检验进行组间比较。 Spearman 检验用于评估牙菌斑/唾液样本中的幽门螺杆菌计数 (1x103 个细胞/mL) 与基线时的临床牙周参数之间的相关性。 显着性水平设置为 p<0.05。 所有统计分析均使用 SPSS 26.0（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）进行。