Effekten av Miswak-tuggstickor på den orala Helicobacter Pylori-infektionen (Miswak)

Etiska aspekter Det experimentella protokollet godkändes av Health Science Center (HSC) etiska kommittén vid Kuwait University (VDR/ED/3331) och är registrerat på ClinicalTrials.gov som NCT02418520 (16/04/2015). Forskningen utfördes enligt principerna i Helsingforsdeklarationen om humanmedicinska experiment. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagare och presenteras i enlighet med riktlinjerna för konsoliderade standarder för rapporteringsförsök (CONSORT).

Studiedesign Detta var en experimentell studie med en randomiserad, cross-over, enkelblinddesign.

Studieprov och datainsamling Denna studie genomfördes bland vanliga patienter som går på tandvårdscentret vid Kuwait University, Kuwait. Patientrekryteringen startade i februari och avslutades i slutet av augusti 2019. PICO-frågan (P = Patientpopulation; I = Intervention av intresse; C = Jämförande intervention; O = Resultat) för denna studie var, "för försökspersoner under olika fasteförhållanden (P), vad är effekten av att använda miswak-tuggstickor tillsammans med tandborste (I) kontra att endast använda tandborste (C) på orala H. pylori-tal (O)?". Frivilliga patienter informerades om studiens komponenter och informerat samtycke erhölls från dem. Saliv- och plackprover samlades in för PCR-screening för att detektera närvaron av H. pylori. Inklusionskriterierna var: 1) försökspersoner med detekterbara nivåer av H. pylori i antingen plack- eller salivprover; 2) inga tecken på parodontit; och, 3) med minst 24 tänder. Försökspersoner som fått antibiotikabehandling eller protonpumpshämmare under de senaste tre månaderna exkluderades från studien.

Rekrytering av studiedeltagare och gruppering Denna studie inkluderade 20 försökspersoner som var på 12 timmars fasta (fastande grupp) och 20 försökspersoner som inte fastade (icke-fastande grupp). Icke-fastande grupppersoner rekryterades mellan februari och april och fastande grupppersoner rekryterades mellan maj och juni 2018 (heliga månaden Ramadan). Vid baslinjen (T0) tilldelades varje försöksperson nummer baserat på den kronologiska ordningen för registreringen i studien. Både de fastande och de icke-fastande försökspersonerna delades slumpmässigt in i grupp-1 och grupp-2 (n=10 vardera). Randomiserad tilldelning av försökspersonerna utfördes genom ett slumpmässigt binärt utfall av en tärning, jämna eller udda tal. Examinatorerna hölls omedvetna om deltagartilldelningen. Grupp-1-personer instruerades att använda både tandborste och miswak (TB+M) i två veckor (T1) och endast tandborste (TB) under de kommande två veckorna (T2); och grupp-2 försökspersoner ombads att endast använda TB under T1 och TB+M under T2, både för de fastande och icke-fastande grupperna. Deltagarna fick instruktioner om hur man använder miswak (fem fingergrepp, skrubbteknik, i 15 minuter, två gånger dagligen21) och TB (modifierad basteknik, i två minuter, två gånger dagligen) av en enda utredare (JKB). Plack- och salivprover samlades in vid T0, T1 och T2.

Frågeformulär Försökspersonerna intervjuades och information samlades in om deras sociodemografiska egenskaper (ålder, kön, utbildning, sysselsättning och inkomst), förekomst av utvalda medicinska tillstånd (hypertoni, diabetes och aktuella mediciner), rökstatus och tandegenskaper (daglig borstningsfrekvens och tidigare tandläkarbesök).

Klinisk undersökning Vid baslinjen (T0) utförde tre utbildade och kalibrerade undersökare de kliniska undersökningarna med hjälp av en munspegel och en manuell tandlossningssond (CP11 Hu Friedy, Europa), med patienten i halvsupinläge på tandläkarstolen (A-dec. , Newberg, OR, USA). De kliniska undersökningarna bedömde Silness & Löe plack index (PI), Löe & Silness gingival index (GI), den kliniska fästförlusten (CAL), sonderingsdjupet (PD) och blödningen vid sondering (BOP) (inter/intra) examinatorns tillförlitlighet >80 %). Dessa mätningar utfördes på sex ytor (mellanspråkig/palatal, disstolingual/palatal, mesiolingual/palatal, distobuckal, midbuckal och mesiobuckal) av alla tänder. Antalet saknade tänder registrerades.

Provtagningsprocedur Plack- och salivprover togs från försökspersonerna vid T0, T1 och T2. Plackprover togs från tandköttsspalten vid den djupaste fickavläsningen och avlägsnades från det kliniska stället med användning av en steril universalkyrett. Provtagningsområdet isolerades med salivejektorer och torkades försiktigt med luft. Spetsen på kyretten fördes in i djupet av sprickan/fickan, flyttades koronalt medan den var i kontakt med tandytan, för att avlägsna både sub- och supragingivalt plack. Proverna nedsänktes sedan i 0,5 ml sterilt destillerat vatten i Eppendorf-rör (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland). För insamling av stimulerade salivprover ombads försökspersonerna att tugga på paraffinvax och upphostade i en plasttratt kopplad till en graderad mätcylinder. Cirka 3 ml saliv samlades upp från varje individ. Omedelbart efter insamling placerades provrören i en behållare fylld med krossad is och transporterades till Oral Microbiology Lab för konservering vid -800C.

Bakterieodling H. pylori JA1-stam erhölls från Medicinska fakulteten, KUWAIT University. Bakteriestammen odlades på tryptikassojaagar kompletterad med defibrinerat fårblod (5%) vid 37 grader Celsius under mikroaerofila förhållanden.

DNA-rening Saliv- och plackprover togs till laboratoriet på is. Efter virvling i 1 minut vid 12 000 x g avlägsnades supernatanten och pelletsen förvarades vid -80°C. DNA från pelletsen renades genom att använda ett DNeasy DNA-reningskit (Qiagen, Tyskland) enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat behandlades pelletsen med lysbuffert och proteinas-K vid 56 grader Celsius under 1 timme. DNA från lyserade prover applicerades på en spinnkolonn och tvättades. Renat DNA eluerades med användning av nukleasfritt vatten och DNA-koncentrationerna mättes med UV-spektrofotometrimetod med användning av NanoDropTM 1000. Genomiskt DNA från H. pylori JA1 renades med användning av samma metod.

Kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qPCR) Efter rening av DNA från proverna mättes mängderna H. pylori med SYBR Green kvantitativ realtids-PCR-metod med användning av H. pylori-artspecifika primrar för ureA-genen: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' och ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTACGAGTTT-3' 44. qPCR-reaktionsblandningen (25 µl) innehöll 12,5 µl SYBR Green mastermix (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 1,0 µl vardera av framåt- och bakåtprimer (0,4 µM), 5,0 µl DNA-mall och 5,5 µl H2O. Den termiska profilen var som följer: en initial denaturering vid 95°C under 10 minuter, 40 cykler av 95°C i 15-30 sekunder, 55°C i 30 sekunder och 72°C i 30 sekunder. Fluorescerande signalupptagning sattes vid förlängningssteget för varje cykel. Alla qPCR-reaktioner kördes på ABapplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR-maskin. Sequence Detection Systems (SDS) (programvaruversion 2.3) användes för dataanalys. Serieutspätt genomiskt DNA från H. pylori JA1 användes för att plotta Ct-värdena mot härledd bakteriecellkoncentration (celler/ml) för varje art och för att konstruera standardkurvor med användning av ovanstående mjukvara. Alla mätningar gjordes i tre exemplar för prover, standarder och kontroller.

Datahantering och statistisk analys En minskning av antalet H. pylori med användning av antingen TB+M eller TB under olika fasteförhållanden var det primära resultatet av intresse i denna studie. Eftersom ingen a priori-information om effekten av miswak på H. pylori fanns tillgänglig, beräknades provstorleken för att detektera en 50 % skillnad mellan grupperna, under antagande av en genomsnittlig 30 % minskning av H. pylori-antal mellan grupperna, med en standardavvikelse på 15 %. För att få en styrka på 80 % och för en risk alfa på 0,05 krävdes 17 patienter per grupp, vilket avrundades till 20, för att ta hänsyn till eventuella avhopp. Skillnaden i mikrobiella räkningar beräknades mellan T0, T1 och T2. Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis test (kontinuerligt beroende variabel) och chi-kvadrattest (kategorisk beroende variabel) användes för att bedöma skillnaderna i de allmänna egenskaperna mellan de två grupperna. Fördelning av H. pylori mellan grupperna undersöktes för normalitet med hjälp av Kolmogorov-Smirnov- och Shapiro-Wilk-testerna. Data var inte normalt fördelade, så förändringen inom gruppen i H. pylori-antal utvärderades med Wilcoxon signed rank test och intergruppsjämförelserna gjordes med Mann-Whitney U-test. Spearmans test användes för att bedöma korrelationen mellan H. pylori-antal (1x103 celler/ml) i plack-/salivprover och de kliniska parodontala parametrarna vid baslinjen. Signifikansnivån sattes till p<0,05. Alla statistiska analyser utfördes med användning av SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).