El efecto de los palitos masticables Miswak en la infección oral por Helicobacter Pylori (Miswak)

Aspectos éticos El protocolo experimental fue aprobado por el comité ético del Health Science Center (HSC) de la Universidad de Kuwait (VDR/ED/3331) y está registrado en ClinicalTrials.gov como NCT02418520 (16/04/2015). La investigación se llevó a cabo de acuerdo con los principios descritos en la declaración de Helsinki sobre experimentación médica humana. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes y se presenta de acuerdo con las pautas de los estándares consolidados de informes de ensayos (CONSORT).

Diseño del estudio Este fue un estudio experimental con un diseño aleatorizado, cruzado, simple ciego.

Muestra del estudio y recopilación de datos Este estudio se realizó entre pacientes regulares que asisten al Centro Dental de la Universidad de Kuwait, Kuwait. El reclutamiento de pacientes comenzó en febrero y se completó a fines de agosto de 2019. La pregunta PICO (P = Población de pacientes; I = Intervención de interés; C = Intervención comparativa; O = Resultado) para este estudio fue, "para sujetos bajo diferentes condiciones de ayuno (P), ¿cuál es el efecto de usar los palitos de mascar miswak junto con cepillo de dientes (I) versus usar solo cepillo de dientes (C) en los recuentos orales de H. pylori (O)?". Los pacientes voluntarios fueron informados sobre los componentes del estudio y se obtuvo su consentimiento informado. Se recogieron muestras de saliva y de placa para realizar un cribado mediante PCR a fin de detectar la presencia de H. pylori. Los criterios de inclusión fueron: 1) sujetos con niveles detectables de H. pylori en muestras de placa o de saliva; 2) sin evidencia de periodontitis; y, 3) con al menos 24 dientes. Los sujetos que recibieron terapia con antibióticos o inhibidores de la bomba de protones en los últimos tres meses fueron excluidos del estudio.

Reclutamiento de los participantes del estudio y agrupación Este estudio incluyó 20 sujetos que estaban en ayunas de 12 horas (grupo en ayunas) y 20 sujetos que no estaban en ayunas (grupo sin ayuno). Los sujetos del grupo sin ayuno se reclutaron entre febrero y abril y los sujetos del grupo en ayunas se reclutaron entre mayo y junio de 2018 (mes sagrado del Ramadán). Al inicio del estudio (T0), a cada sujeto se le asignaron números según el orden cronológico de inscripción en el estudio. Tanto los sujetos en ayunas como los que no ayunaban se subdividieron aleatoriamente en el Grupo 1 y el Grupo 2 (n = 10 cada uno). La asignación aleatoria de los sujetos se llevó a cabo mediante un resultado binario aleatorio de un dado, números pares o impares. Los examinadores no estaban al tanto de la asignación de los participantes. Los sujetos del grupo 1 recibieron instrucciones de usar cepillo de dientes y miswak (TB+M) durante dos semanas (T1) y solo cepillo de dientes (TB) durante las próximas dos semanas (T2); y, a los sujetos del Grupo 2 se les pidió que usaran solo TB durante T1 y TB+M durante T2, tanto para los grupos en ayunas como para los que no ayunaban. Los participantes recibieron instrucciones sobre cómo usar miswak (técnica de frotamiento con cinco dedos, durante 15 minutos, dos veces al día21) y TB (técnica de Bass modificada, durante dos minutos, dos veces al día) por un solo investigador (JKB). Las muestras de placa y saliva se recogieron en T0, T1 y T2.

Cuestionario Se entrevistó a los sujetos y se recolectó información sobre sus características sociodemográficas (edad, sexo, educación, empleo e ingresos), presencia de condiciones médicas seleccionadas (hipertensión, diabetes y medicamentos actuales), tabaquismo y características dentales (frecuencia de cepillado diario). y visita dental previa).

Examen clínico Al inicio del estudio (T0), tres examinadores capacitados y calibrados realizaron los exámenes clínicos utilizando un espejo bucal y una sonda periodontal manual (CP11 Hu Friedy, Europa), con el paciente en posición semisupina en el sillón dental (A-dec , Newberg, Oregón, EE. UU.). Los exámenes clínicos evaluaron el índice de placa (PI) de Silness & Löe, el índice gingival (GI) de Löe & Silness, la pérdida de inserción clínica (CAL), la profundidad de sondaje (PD) y el sangrado al sondaje (BOP) (inter/intra). fiabilidad del examinador >80%). Estas mediciones se realizaron en seis superficies (mediolingual/palatina, distolingual/palatina, mesiolingual/palatina, distovestibular, mediovestibular y mesiovestibular) de todos los dientes. Se registró el número de dientes faltantes.

Procedimiento de recogida de muestras Se recogieron muestras de placa y de saliva de los sujetos en T0, T1 y T2. Se tomaron muestras de placa del surco gingival en la lectura de la bolsa más profunda y se extrajeron del sitio clínico usando una cureta universal estéril. El área de muestreo se aisló utilizando eyectores de saliva y se secó suavemente con aire. La punta de la cureta se insertó en las profundidades de la grieta/bolsa, se movió coronalmente mientras estaba en contacto con la superficie del diente, para eliminar la placa subgingival y supragingival. A continuación, las muestras se sumergieron en 0,5 ml de agua destilada estéril en tubos Eppendorf (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). Para la recolección de muestras de saliva estimulada, se pidió a los sujetos que masticaran cera de parafina y expectoraran en un embudo de plástico conectado a un cilindro de medición graduado. Se recogieron alrededor de 3 ml de saliva de cada sujeto. Inmediatamente después de la recolección, los tubos de muestra se colocaron en un recipiente lleno de hielo picado y se transportaron al laboratorio de Microbiología Oral para su conservación a -800C.

El cultivo bacteriano de la cepa JA1 de H. pylori se obtuvo de la Facultad de Medicina de la Universidad de KUWAIT. La cepa bacteriana se cultivó en agar tripticasa soja complementado con sangre de oveja desfibrinada (5%) a 37 grados Celsius en condiciones microaerófilas.

Purificación de ADN Las muestras de saliva y placa se llevaron al laboratorio en hielo. Después de agitar en vórtex durante 1 minuto a 12000 × g, se eliminó el sobrenadante y los sedimentos se almacenaron a -80 °C. El ADN de los sedimentos se purificó utilizando un kit de purificación de ADN DNeasy (Qiagen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, los sedimentos se trataron con tampón de lisis y proteinasa-K a 56 grados Celsius durante 1 h. El ADN de las muestras lisadas se aplicó a una columna giratoria y se lavó. El ADN purificado se eluyó con agua libre de nucleasas y las concentraciones de ADN se midieron mediante el método de espectrofotometría UV con NanoDropTM 1000. El ADN genómico de H. pylori JA1 se purificó utilizando el mismo método.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) Después de purificar el ADN de las muestras, las cantidades de H. pylori se midieron mediante el método de PCR en tiempo real cuantitativo SYBR Green utilizando cebadores específicos de la especie H. pylori para el gen ureA: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' y ureA-R: 5'-GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. La mezcla de reacción de qPCR (25 µl) contenía 12,5 µl de mezcla maestra SYBR Green (kit Power SYBR Green®, Applied Biosystems), 1,0 µl de cebador directo e inverso (0,4 µM), 5,0 µl de plantilla de ADN y 5,5 µl de H2O. El perfil térmico fue el siguiente: una desnaturalización inicial a 95°C por 10min, 40 ciclos de 95°C por 15-30s, 55°C por 30s y 72°C por 30s. La adquisición de señales fluorescentes se fijó en el paso de elongación de cada ciclo. Todas las reacciones de qPCR se realizaron en una máquina de PCR en tiempo real ABpplied Biosystems® Fast 7500. Se utilizaron sistemas de detección de secuencias (SDS) (versión de software 2.3) para el análisis de datos. El ADN genómico diluido en serie de H. pylori JA1 se usó en las reacciones para trazar los valores de Ct frente a la concentración de células bacterianas deducida (células/mL) para cada especie y para construir curvas estándar usando el software anterior. Todas las medidas se tomaron por triplicado para muestras, patrones y controles.

Gestión de datos y análisis estadístico Una reducción en el recuento de H. pylori utilizando TB+M o TB en diferentes condiciones de ayuno fue el principal resultado de interés en este estudio. Como no se disponía de información a priori sobre el efecto de miswak en H. pylori, se calculó el tamaño de la muestra para detectar una diferencia del 50 % entre los grupos, suponiendo una reducción media del 30 % en los recuentos de H. pylori entre los grupos, con una desviación estándar del 15%. Para obtener una potencia del 80% y un riesgo alfa de 0,05, se requerían 17 pacientes por grupo, que se redondeó a 20 para tener en cuenta los posibles abandonos. La diferencia en los recuentos microbianos se calculó entre T0, T1 y T2. Se utilizaron la prueba U de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis (variable dependiente continua) y la prueba de chi-cuadrado (variable dependiente categórica) para evaluar las diferencias en las características generales entre los dos grupos. Se exploró la normalidad de la distribución de H. pylori entre los grupos mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Shapiro-Wilk. Los datos no se distribuyeron normalmente, por lo que el cambio intragrupo en los recuentos de H. pylori se evaluó con la prueba de rango con signo de Wilcoxon y las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. Se utilizó la prueba de Spearman para evaluar la correlación entre los recuentos de H. pylori (1 x 103 células/mL) en muestras de placa/saliva y los parámetros periodontales clínicos al inicio del estudio. El nivel de significación se fijó en p<0,05. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.).