L'effetto dei bastoncini da masticare Miswak sull'infezione orale da Helicobacter Pylori (Miswak)

Aspetti etici Il protocollo sperimentale è stato approvato dal comitato etico dell'Health Science Center (HSC) dell'Università del Kuwait (VDR/ED/3331) ed è registrato su ClinicalTrials.gov come NCT02418520 (16/04/2015). La ricerca è stata condotta secondo i principi delineati nella dichiarazione di Helsinki sulla sperimentazione medica umana. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti ed è presentato in conformità alle linee guida consolidate sugli standard di segnalazione degli studi (CONSORT).

Disegno dello studio Si trattava di uno studio sperimentale con un disegno randomizzato, incrociato, in singolo cieco.

Campione dello studio e raccolta dei dati Questo studio è stato condotto tra pazienti abituali che frequentavano il Centro Odontoiatrico dell'Università del Kuwait, Kuwait. Il reclutamento dei pazienti è iniziato a febbraio ed è stato completato entro la fine di agosto 2019. La domanda PICO (P = Popolazione di pazienti; I = Intervento di interesse; C = Intervento comparativo; O = Risultato) per questo studio era: "per i soggetti in diverse condizioni di digiuno (P), qual è l'effetto dell'uso di bastoncini da masticare miswak lungo con lo spazzolino da denti (I) rispetto all'utilizzo del solo spazzolino da denti (C) sulla conta orale di H. pylori (O)?". I pazienti volontari sono stati informati sui componenti dello studio e da loro è stato ottenuto il consenso informato. Sono stati raccolti campioni di saliva e placca per lo screening PCR per rilevare la presenza di H. pylori. I criteri di inclusione erano: 1) soggetti con livelli rilevabili di H. pylori nella placca o nei campioni salivari; 2) nessuna evidenza di parodontite; e, 3) con almeno 24 denti. I soggetti che hanno ricevuto terapia antibiotica o inibitori della pompa protonica negli ultimi tre mesi sono stati esclusi dallo studio.

Reclutamento dei partecipanti allo studio e raggruppamento Questo studio ha incluso 20 soggetti che erano a digiuno da 12 ore (gruppo a digiuno) e 20 soggetti che non erano a digiuno (gruppo non a digiuno). I soggetti del gruppo non a digiuno sono stati reclutati tra febbraio e aprile e i soggetti del gruppo a digiuno sono stati reclutati tra maggio e giugno 2018 (mese sacro del Ramadan). Al basale (T0), a ciascun soggetto è stato assegnato un numero in base all'ordine cronologico di arruolamento nello studio. Entrambi i soggetti a digiuno e non a digiuno sono stati suddivisi in modo casuale nel Gruppo 1 e nel Gruppo 2 (n = 10 ciascuno). L'assegnazione randomizzata dei soggetti è stata effettuata mediante un risultato binario casuale di un dado, numeri pari o dispari. Gli esaminatori sono stati tenuti all'oscuro dell'assegnazione dei partecipanti. I soggetti del gruppo 1 sono stati istruiti a utilizzare sia lo spazzolino da denti che il miswak (TB+M) per due settimane (T1) e solo lo spazzolino da denti (TB) per le due settimane successive (T2); e, ai soggetti del gruppo 2 è stato chiesto di utilizzare solo TB durante T1 e TB+M durante T2, sia per i gruppi a digiuno che per quelli non a digiuno. Ai partecipanti sono state fornite istruzioni su come utilizzare miswak (tecnica di presa con cinque dita, scrub, per 15 minuti, due volte al giorno21) e TB (tecnica di Bass modificata, per due minuti, due volte al giorno) da un singolo investigatore (JKB). I campioni di placca e saliva sono stati raccolti a T0, T1 e T2.

Questionario I soggetti sono stati intervistati e sono state raccolte informazioni sulle loro caratteristiche socio-demografiche (età, sesso, istruzione, occupazione e reddito), presenza di condizioni mediche selezionate (ipertensione, diabete e farmaci in corso), stato di fumo e caratteristiche dentali (frequenza giornaliera di spazzolamento e precedente visita odontoiatrica).

Esame clinico Al basale (T0), tre esaminatori addestrati e calibrati hanno eseguito gli esami clinici utilizzando uno specchietto per la bocca e una sonda parodontale manuale (CP11 Hu Friedy, Europa), con il paziente in posizione semi-supina sulla poltrona del dentista (A-dec , Newberg, OR, Stati Uniti). Gli esami clinici hanno valutato l'indice della placca di Silness & Löe (PI), l'indice gengivale di Löe & Silness (GI), la perdita di attacco clinico (CAL), la profondità di sondaggio (PD) e il sanguinamento al sondaggio (BOP) (inter/intra attendibilità dell'esaminatore >80%). Queste misurazioni sono state eseguite su sei superfici (midlinguale/palatale, distolinguale/palatale, mesiolinguale/palatale, distobuccale, mediobuccale e mesiobuccale) di tutti i denti. È stato registrato il numero di denti mancanti.

Procedura di raccolta dei campioni Campioni di placca e saliva sono stati raccolti dai soggetti a T0, T1 e T2. I campioni di placca sono stati prelevati dalla fessura gengivale alla lettura della tasca più profonda e rimossi dal sito clinico utilizzando una curette universale sterile. L'area di campionamento è stata isolata mediante aspiratori salivari e asciugata delicatamente all'aria. La punta della curette è stata inserita nella profondità della fessura/tasca, spostata coronalmente mentre era a contatto con la superficie del dente, per rimuovere sia la placca sub che sopragengivale. I campioni sono stati quindi immersi in 0,5 ml di acqua distillata sterile in provette Eppendorf (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Amburgo, Germania). Per la raccolta di campioni salivari stimolati, ai soggetti è stato chiesto di masticare cera di paraffina ed espettorato in un imbuto di plastica collegato a un cilindro graduato. Da ciascun soggetto sono stati raccolti circa 3 ml di saliva. Immediatamente dopo la raccolta, le provette dei campioni sono state poste in un contenitore riempito di ghiaccio tritato e trasportate al laboratorio di microbiologia orale per la conservazione a -800°C.

La coltura batterica del ceppo H. pylori JA1 è stata ottenuta dalla Facoltà di Medicina, Università KUWAIT. Il ceppo batterico è stato coltivato su agar di soia tripticasi integrato con sangue di montone defibrinato (5%) a 37 gradi Celsius in condizioni microaerofile.

Purificazione del DNA Campioni di saliva e placca sono stati portati in laboratorio su ghiaccio. Dopo vortex per 1 minuto a 12000 × g, il surnatante è stato rimosso e i pellet sono stati conservati a -80°C. Il DNA dei pellet è stato purificato utilizzando un kit di purificazione del DNA DNeasy (Qiagen, Germania) secondo le istruzioni del produttore. In breve, i pellet sono stati trattati con tampone di lisi e proteinasi-K a 56 gradi Celsius per 1 ora. Il DNA dei campioni lisati è stato applicato su una colonna rotante e lavato. Il DNA purificato è stato eluito utilizzando acqua priva di nucleasi e le concentrazioni di DNA sono state misurate mediante il metodo spettrofotometrico UV utilizzando NanoDropTM 1000. Il DNA genomico di H. pylori JA1 è stato purificato utilizzando lo stesso metodo.

Reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR) Dopo aver purificato il DNA dai campioni, le quantità di H. pylori sono state misurate mediante il metodo PCR quantitativo in tempo reale SYBR Green utilizzando primer specifici per specie H. pylori per il gene ureA: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' e ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. La miscela di reazione qPCR (25 µl) conteneva 12,5 µl di master mix SYBR Green (Kit Power SYBR Green®, Applied Biosystems), 1,0 µl ciascuno di forward primer e reverse primer (0,4 µM), 5,0 µl di stampo di DNA e 5,5 µl di H2O. Il profilo termico è stato il seguente: una denaturazione iniziale a 95°C per 10min, 40 cicli di 95°C per 15-30s, 55°C per 30s e 72°C per 30s. L'acquisizione del segnale fluorescente è stata impostata nella fase di allungamento di ciascun ciclo. Tutte le reazioni qPCR sono state eseguite su una macchina per PCR in tempo reale ABpplied Biosystems® Fast 7500. Per l'analisi dei dati è stato utilizzato Sequence Detection Systems (SDS) (versione software 2.3). Il DNA genomico diluito in serie da H. pylori JA1 è stato utilizzato per le reazioni per tracciare i valori Ct rispetto alla concentrazione cellulare batterica dedotta (cellule/mL) per ciascuna specie e per costruire curve standard utilizzando il software di cui sopra. Tutte le misurazioni sono state effettuate in triplicato per campioni, standard e controlli.

Gestione dei dati e analisi statistica Una riduzione della conta di H. pylori utilizzando TB+M o TB in diverse condizioni di digiuno è stato l'esito primario di interesse in questo studio. Poiché non erano disponibili informazioni a priori sull'effetto del miswak su H. pylori, la dimensione del campione è stata calcolata per rilevare una differenza del 50% tra i gruppi, ipotizzando una riduzione media del 30% nella conta di H. pylori tra i gruppi, con una deviazione standard del 15%. Per ottenere una potenza dell'80% e per un rischio alfa di 0,05, sono stati richiesti 17 pazienti per gruppo, arrotondati a 20, per tenere conto di eventuali abbandoni. La differenza nelle conte microbiche è stata calcolata tra T0, T1 e T2. Per valutare le differenze nelle caratteristiche generali tra i due gruppi sono stati utilizzati il ​​test U di Mann-Whitney o il test di Kruskal-Wallis (variabile dipendente continua) e il test chi-quadrato (variabile dipendente categoriale). La distribuzione di H. pylori tra i gruppi è stata esplorata per la normalità utilizzando i test di Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk. I dati non erano distribuiti normalmente, quindi la variazione intragruppo nei conteggi di H. pylori è stata valutata con il test dei ranghi con segno di Wilcoxon e i confronti tra gruppi sono stati effettuati utilizzando il test U di Mann-Whitney. Il test di Spearman è stato utilizzato per valutare la correlazione tra le conte di H. pylori (1x103 cellule/mL) nei campioni di placca/salivare ei parametri clinici parodontali al basale. Il livello di significatività è stato fissato a p<0,05. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).