Het effect van Miswak-kauwsticks op de orale Helicobacter Pylori-infectie (Miswak)

Ethische aspecten Het experimentele protocol is goedgekeurd door de ethische commissie van het Health Science Center (HSC) van de Kuwait University (VDR/ED/3331) en is geregistreerd op ClinicalTrials.gov als NCT02418520 (16/04/2015). Onderzoek werd uitgevoerd volgens de principes uiteengezet in de verklaring van Helsinki over medische experimenten op mensen. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers en wordt gepresenteerd in overeenstemming met de richtlijnen voor geconsolideerde rapportagestandaarden (CONSORT).

Studieopzet Dit was een experimentele studie met een gerandomiseerde, cross-over, enkelblinde opzet.

Onderzoekssteekproef en gegevensverzameling Dit onderzoek werd uitgevoerd onder reguliere patiënten die het Tandheelkundig Centrum van de Universiteit van Koeweit, Koeweit, bezochten. De werving van patiënten begon in februari en was eind augustus 2019 voltooid. De PICO-vraag (P = Patiëntenpopulatie; I = Interventie van belang; C = Vergelijkende interventie; O = Uitkomst) voor deze studie was: "voor proefpersonen onder verschillende nuchtere omstandigheden (P), wat is het effect van het gebruik van miswak-kauwstokjes langs met tandenborstel (I) versus alleen tandenborstel (C) gebruiken bij de orale H. pylori-tellingen (O)?". Vrijwillige patiënten werden ingelicht over de studiecomponenten en geïnformeerde toestemming werd van hen verkregen. Speeksel- en plaquemonsters werden verzameld voor PCR-screening om de aanwezigheid van H. pylori te detecteren. De opnamecriteria waren: 1) proefpersonen met detecteerbare niveaus van H. pylori in plaque- of speekselmonsters; 2) geen bewijs van parodontitis; en, 3) met ten minste 24 tanden. Proefpersonen die in de afgelopen drie maanden antibiotische therapie of protonpompremmers kregen, werden uitgesloten van deelname aan het onderzoek.

Rekrutering van studiedeelnemers en groepering Deze studie omvatte 20 proefpersonen die 12 uur aan het vasten waren (vastende groep) en 20 proefpersonen die niet aan het vasten waren (niet-vastende groep). Niet-nuchtere groepsproefpersonen werden gerekruteerd tussen februari en april en vastende groepsproefpersonen werden gerekruteerd tussen mei en juni 2018 (heilige maand Ramadan). Bij baseline (T0) kreeg elke proefpersoon nummers toegewezen op basis van de chronologische volgorde van deelname aan het onderzoek. Zowel de nuchtere als de niet-nuchtere proefpersonen werden willekeurig onderverdeeld in Groep-1 en Groep-2 (elk n=10). Gerandomiseerde toewijzing van de proefpersonen werd uitgevoerd door een willekeurige binaire uitkomst van een dobbelsteen, even of oneven getallen. De examinatoren werden niet op de hoogte gehouden van de toewijzing van de deelnemers. Groep-1-proefpersonen kregen de instructie om gedurende twee weken zowel tandenborstel als miswak (TB+M) te gebruiken (T1) en alleen tandenborstel (TB) gedurende de volgende twee weken (T2); en groep 2-proefpersonen werd gevraagd om alleen tbc te gebruiken tijdens T1 en TB+M tijdens T2, voor zowel de nuchtere als de niet-nuchtere groep. De deelnemers kregen instructies over het gebruik van miswak (vijf vingers, scrubtechniek, gedurende 15 minuten, tweemaal daags21) en TB (gemodificeerde bastechniek, gedurende twee minuten, tweemaal daags) door een enkele onderzoeker (JKB). Plaque- en speekselmonsters werden verzameld op T0, T1 en T2.

Vragenlijst De proefpersonen werden geïnterviewd en er werd informatie verzameld over hun sociaal-demografische kenmerken (leeftijd, geslacht, opleiding, werk en inkomen), aanwezigheid van geselecteerde medische aandoeningen (hypertensie, diabetes en huidige medicatie), rookstatus en gebitskenmerken (dagelijkse poetsfrequentie en vorig tandartsbezoek).

Klinisch onderzoek Bij baseline (T0) voerden drie getrainde en gekalibreerde examinatoren de klinische onderzoeken uit met behulp van een mondspiegel en een manuele parodontale sonde (CP11 Hu Friedy, Europa), met de patiënt in halfliggende positie op de tandartsstoel (A-dec , Newberg, OR, VS). De klinische onderzoeken beoordeelden de Silness & Löe plaque index (PI), de Löe & Silness gingival index (GI), het klinische hechtingsverlies (CAL), de sondediepte (PD) en de bloeding bij sonderen (BOP) (inter/intra beoordelaarsbetrouwbaarheid >80%). Deze metingen werden uitgevoerd op zes oppervlakken (midlinguaal/palataal, distolinguaal/palataal, mesiolinguaal/palataal, distobuccaal, midbuccaal en mesiobuccaal) van alle tanden. Het aantal ontbrekende tanden werd geregistreerd.

Procedure voor het verzamelen van monsters Er werden plaque- en speekselmonsters verzameld van de proefpersonen op T0, T1 en T2. Plaquemonsters werden genomen uit de gingivale spleet bij de diepste pocketmeting en verwijderd van de klinische plaats met behulp van een steriele universele curette. Het bemonsteringsgebied werd geïsoleerd met behulp van speekseluitwerpers en voorzichtig aan de lucht gedroogd. De punt van de curette werd ingebracht in de diepte van de spleet/pocket, coronaal bewogen terwijl hij in contact was met het tandoppervlak, om zowel sub- als supragingivale plaque te verwijderen. De monsters werden vervolgens ondergedompeld in 0,5 ml steriel gedestilleerd water in Eppendorf-buizen (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland). Voor het verzamelen van gestimuleerde speekselmonsters werd proefpersonen gevraagd op paraffinewas te kauwen en in een plastic trechter te spuwen die was verbonden met een maatcilinder met schaalverdeling. Van elke proefpersoon werd ongeveer 3 ml speeksel verzameld. Onmiddellijk na verzameling werden de monsterbuisjes in een container gevuld met crushed ijs geplaatst en naar het laboratorium voor orale microbiologie getransporteerd om te worden bewaard bij -80°C.

Bacteriële cultuur H. pylori JA1-stam werd verkregen van de Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van KOEWEIT. De bacteriestam werd gekweekt op trypticase-soja-agar aangevuld met gedefibrineerd schapenbloed (5%) bij 37 graden Celsius onder micro-aerofiele omstandigheden.

DNA-zuivering Speeksel- en plaquemonsters werden op ijs naar het laboratorium gebracht. Na 1 minuut vortexen bij 12.000 x g werd het supernatant verwijderd en werden de pellets bewaard bij -80°C. DNA van de pellets werd gezuiverd met behulp van een DNeasy DNA-zuiveringskit (Qiagen, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. In het kort werden de pellets gedurende 1 uur bij 56 graden Celsius behandeld met lysisbuffer en proteïnase-K. DNA van gelyseerde monsters werd aangebracht op een spinkolom en gewassen. Gezuiverd DNA werd geëlueerd met behulp van nucleasevrij water en de DNA-concentraties werden gemeten met de UV-spectrofotometrische methode met behulp van NanoDropTM 1000. Genomisch DNA van H. pylori JA1 werd gezuiverd door gebruik te maken van dezelfde methode.

Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qPCR) Na zuivering van het DNA uit de monsters werden de hoeveelheden H. pylori gemeten met de kwantitatieve real-time PCR-methode van SYBR Green met behulp van H. pylori soortspecifieke primers voor het ureA-gen: ureA-F : 5'-CGGTGGCAAGCATGATCCAT-3' en ureA-R: 5'-GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. Het qPCR-reactiemengsel (25 µl) bevatte 12,5 µl SYBR Green-mastermix (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 1,0 µl voorwaartse en achterwaartse primer (0,4 µM), 5,0 µl DNA-template en 5,5 µl H2O. Het thermische profiel was als volgt: een initiële denaturatie bij 95°C gedurende 10 minuten, 40 cycli van 95°C gedurende 15-30 seconden, 55 °C gedurende 30 seconden en 72 °C gedurende 30 seconden. Fluorescerende signaalverwerving werd ingesteld bij de verlengingsstap van elke cyclus. Alle qPCR-reacties werden uitgevoerd op ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR-machine. Sequence Detection Systems (SDS) (softwareversie 2.3) werd gebruikt voor data-analyse. Serieel verdund genomisch DNA van H. pylori JA1 werd gebruikt voor de reacties voor het uitzetten van de Ct-waarden tegen de afgeleide bacteriële celconcentratie (cellen/ml) voor elke soort en om standaardcurven te construeren met behulp van de bovenstaande software. Alle metingen werden in drievoud uitgevoerd voor monsters, standaarden en controles.

Gegevensbeheer en statistische analyse Een verlaging van het aantal H. pylori met behulp van TB+M of TB onder verschillende nuchtere omstandigheden was het primaire resultaat van belang in deze studie. Aangezien er geen a priori informatie over het effect van miswak op H. pylori beschikbaar was, werd de steekproefomvang berekend om een ​​verschil van 50% tussen de groepen te detecteren, uitgaande van een gemiddelde 30% reductie in H. pylori-tellingen tussen de groepen, met een standaarddeviatie van 15%. Voor een power van 80% en voor een risico-alfa van 0,05 waren 17 patiënten per groep nodig, afgerond op 20, om rekening te houden met eventuele uitvallers. Het verschil in de microbiële tellingen werd berekend tussen T0, T1 en T2. Mann-Whitney U-test of Kruskal-Wallis-test (continue afhankelijke variabele) en chi-kwadraattest (categorische afhankelijke variabele) werden gebruikt om de verschillen in de algemene kenmerken tussen de twee groepen te beoordelen. Verdeling van H. pylori tussen de groepen werd onderzocht op normaliteit met behulp van de Kolmogorov-Smirnov- en Shapiro-Wilk-tests. De gegevens waren niet normaal verdeeld, dus de intragroepsverandering in H. pylori-tellingen werd geëvalueerd met de Wilcoxon ondertekende rangtest en de intergroepsvergelijkingen werden gemaakt met behulp van de Mann-Whitney U-test. Spearman's test werd gebruikt om de correlatie te beoordelen tussen de H. pylori-tellingen (1x103 cellen/ml) in plaque-/speekselmonsters en de klinische parodontale parameters bij baseline. Het significantieniveau werd ingesteld op p<0,05. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, VS).