Die Wirkung von Miswak-Kausticks auf die orale Helicobacter-pylori-Infektion (Miswak)

Ethische Aspekte Das Versuchsprotokoll wurde von der Ethikkommission des Health Science Center (HSC) der Universität Kuwait (VDR/ED/3331) genehmigt und ist bei ClinicalTrials.gov als NCT02418520 (16.04.2015) registriert. Die Forschung wurde gemäß den Grundsätzen durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki über medizinische Experimente am Menschen dargelegt sind. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern eingeholt und wird in Übereinstimmung mit den Richtlinien der konsolidierten Standards für die Berichterstattung über Studien (CONSORT) vorgelegt.

Studiendesign Dies war eine experimentelle Studie mit einem randomisierten, einfach verblindeten Crossover-Design.

Studienstichprobe und Datenerhebung Diese Studie wurde unter regelmäßigen Patienten durchgeführt, die das Dental Center der Kuwait University, Kuwait, besuchten. Die Patientenrekrutierung begann im Februar und wurde Ende August 2019 abgeschlossen. Die PICO-Frage (P = Patientenpopulation; I = Interessierende Intervention; C = Vergleichende Intervention; O = Ergebnis) für diese Studie lautete: „Welche Wirkung hat die Verwendung von Miswak-Kausticks für Probanden unter verschiedenen Fastenbedingungen (P). mit Zahnbürste (I) im Vergleich zur ausschließlichen Verwendung einer Zahnbürste (C) bei den oralen H. pylori-Zählungen (O)?". Freiwillige Patienten wurden über die Studienkomponenten informiert und ihre Einwilligung wurde eingeholt. Speichel- und Plaqueproben wurden für das PCR-Screening gesammelt, um das Vorhandensein von H. pylori nachzuweisen. Die Einschlusskriterien waren: 1) Probanden mit nachweisbaren Mengen an H. pylori entweder in Plaque- oder Speichelproben; 2) kein Hinweis auf Parodontitis; und 3) mit mindestens 24 Zähnen. Probanden, die innerhalb der letzten drei Monate eine Antibiotikatherapie oder Protonenpumpenhemmer erhielten, wurden von der Studie ausgeschlossen.

Rekrutierung von Studienteilnehmern und Gruppierung Diese Studie umfasste 20 Probanden, die 12 Stunden lang nüchtern waren (Fastengruppe) und 20 Probanden, die nicht nüchtern waren (Nichtfastengruppe). Probanden der Nicht-Fastengruppe wurden zwischen Februar und April und Probanden der Fastengruppe zwischen Mai und Juni 2018 (heiliger Monat Ramadan) rekrutiert. Zu Studienbeginn (T0) wurden jedem Probanden Nummern basierend auf der chronologischen Reihenfolge der Einschreibung in die Studie zugewiesen. Sowohl die nüchternen als auch die nicht nüchternen Probanden wurden zufällig in Gruppe-1 und Gruppe-2 (jeweils n=10) unterteilt. Die randomisierte Zuordnung der Probanden erfolgte durch ein zufälliges binäres Ergebnis eines Würfels, gerade oder ungerade Zahlen. Die Prüfer wurden über die Teilnehmerzuteilung nicht informiert. Die Probanden der Gruppe 1 wurden angewiesen, zwei Wochen lang (T1) sowohl Zahnbürste als auch Miswak (TB+M) und in den nächsten zwei Wochen (T2) nur Zahnbürste (TB) zu verwenden; und die Probanden der Gruppe 2 wurden gebeten, nur TB während T1 und TB+M während T2 sowohl für die nüchterne als auch für die nicht nüchterne Gruppe zu verwenden. Die Teilnehmer erhielten Anweisungen zur Anwendung von Miswak (Fünf-Finger-Griff, Peeling-Technik, für 15 Minuten, zweimal täglich21) und TB (modifizierte Bass-Technik, für zwei Minuten, zweimal täglich) von einem einzigen Prüfer (JKB). Plaque- und Speichelproben wurden bei T0, T1 und T2 gesammelt.

Fragebogen Die Probanden wurden befragt und Informationen zu ihren soziodemografischen Merkmalen (Alter, Geschlecht, Bildung, Beschäftigung und Einkommen), Vorliegen ausgewählter Erkrankungen (Bluthochdruck, Diabetes und aktuelle Medikamente), Raucherstatus und Zahnmerkmale (tägliche Putzhäufigkeit) erhoben und vorheriger Zahnarztbesuch).

Klinische Untersuchung Zu Studienbeginn (T0) führten drei geschulte und kalibrierte Untersucher die klinischen Untersuchungen unter Verwendung eines Mundspiegels und einer manuellen Parodontalsonde (CP11 Hu Friedy, Europa) durch, wobei der Patient in Halbrückenlage auf dem Behandlungsstuhl lag (A-dec , Newberg, OR, USA). Die klinischen Untersuchungen bewerteten den Silness & Löe-Plaque-Index (PI), den Löe & Silness-Gingiva-Index (GI), den klinischen Attachmentverlust (CAL), die Sondierungstiefe (PD) und die Blutung bei Sondierung (BOP) (inter/intra Prüferreliabilität >80%). Diese Messungen wurden an sechs Oberflächen (mittlingual/palatinal, distolingual/palatinal, mesiolingual/palatinal, distobukkale, mediabukkale und mesiobukkale) aller Zähne durchgeführt. Die Zahl der fehlenden Zähne wurde notiert.

Probenentnahmeverfahren Plaque- und Speichelproben wurden von den Probanden zu T0, T1 und T2 gesammelt. Plaqueproben wurden aus der Zahnfleischspalte bei der tiefsten Taschenablesung entnommen und mit einer sterilen Universalkürette von der klinischen Stelle entfernt. Die Probenahmebereiche wurden mit Speichelziehern isoliert und schonend an der Luft getrocknet. Die Spitze der Kürette wurde in die Tiefe der Spalte/Tasche eingeführt und bei Kontakt mit der Zahnoberfläche koronal bewegt, um sowohl sub- als auch supragingivale Plaque zu entfernen. Die Proben wurden dann in 0,5 ml steriles destilliertes Wasser in Eppendorf-Röhrchen (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) eingetaucht. Für die Entnahme von stimulierten Speichelproben wurden die Probanden aufgefordert, Paraffinwachs zu kauen und in einen Plastiktrichter zu spucken, der mit einem Messzylinder verbunden war. Etwa 3 ml Speichel wurden von jedem Probanden gesammelt. Unmittelbar nach der Entnahme wurden die Probenröhrchen in einen mit zerstoßenem Eis gefüllten Behälter gegeben und zur Aufbewahrung bei –80°C in das Labor für orale Mikrobiologie transportiert.

Die Bakterienkultur H. pylori Stamm JA1 wurde von der medizinischen Fakultät der KUWAIT-Universität erhalten. Der Bakterienstamm wurde auf Trypticase-Soja-Agar, ergänzt mit defibriniertem Schafblut (5 %), bei 37 Grad Celsius unter mikroaerophilen Bedingungen gezüchtet.

DNA-Reinigung Speichel- und Plaqueproben wurden auf Eis ins Labor gebracht. Nach 1-minütigem Vortexen bei 12000 x g wurde der Überstand entfernt und die Pellets bei -80ºC gelagert. DNA aus den Pellets wurde unter Verwendung eines DNeasy DNA Purification Kit (Qiagen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Kurz gesagt wurden die Pellets mit Lysepuffer und Proteinase-K bei 56 Grad Celsius für 1 Stunde behandelt. DNA aus lysierten Proben wurde auf eine Spin-Säule aufgetragen und gewaschen. Gereinigte DNA wurde mit nukleasefreiem Wasser eluiert und die DNA-Konzentrationen wurden durch UV-Spektrophotometrie mit NanoDropTM 1000 gemessen. Genomische DNA von H. pylori JA1 wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens gereinigt.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) Nach Reinigung der DNA aus den Proben wurden die Mengen an H. pylori durch die quantitative Echtzeit-PCR-Methode SYBR Green unter Verwendung von H. pylori-Spezies-spezifischen Primern für das ureA-Gen gemessen: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' und ureA-R: 5'-GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. Das qPCR-Reaktionsgemisch (25 µl) enthielt 12,5 µl SYBR Green Mastermix (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), je 1,0 µl Forward- und Reverse-Primer (0,4 µM), 5,0 µl DNA-Matrize und 5,5 µl H2O. Das thermische Profil war wie folgt: eine anfängliche Denaturierung bei 95°C für 10 min, 40 Zyklen bei 95°C für 15–30 s, 55°C für 30 s und 72°C für 30 s. Die Fluoreszenzsignalerfassung wurde auf den Elongationsschritt jedes Zyklus eingestellt. Alle qPCR-Reaktionen wurden auf einem ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR-Gerät durchgeführt. Sequence Detection Systems (SDS) (Softwareversion 2.3) wurde für die Datenanalyse verwendet. Reihenverdünnte genomische DNA von H. pylori JA1 wurde in den Reaktionen zum Auftragen der Ct-Werte gegen die abgeleitete Bakterienzellkonzentration (Zellen/ml) für jede Spezies und zum Konstruieren von Standardkurven unter Verwendung der obigen Software verwendet. Alle Messungen wurden dreifach für Proben, Standards und Kontrollen durchgeführt.

Datenverwaltung und statistische Analyse Eine Verringerung der H. pylori-Zahl unter Verwendung von entweder TB+M oder TB unter verschiedenen Fastenbedingungen war das primäre interessierende Ergebnis dieser Studie. Da keine A-priori-Informationen über die Wirkung von Miswak auf H. pylori verfügbar waren, wurde die Stichprobengröße so berechnet, dass ein Unterschied von 50 % zwischen den Gruppen festgestellt werden konnte, wobei eine durchschnittliche Verringerung der H. pylori-Zahlen zwischen den Gruppen um 30 % mit einer Standardabweichung angenommen wurde von 15 %. Um eine Power von 80 % und ein Risiko-Alpha von 0,05 zu erhalten, waren 17 Patienten pro Gruppe erforderlich, was auf 20 gerundet wurde, um mögliche Dropouts zu berücksichtigen. Der Unterschied in den Keimzahlen wurde zwischen T0, T1 und T2 berechnet. Der Mann-Whitney-U-Test oder Kruskal-Wallis-Test (kontinuierliche abhängige Variable) und der Chi-Quadrat-Test (kategoriale abhängige Variable) wurden verwendet, um die Unterschiede in den allgemeinen Merkmalen zwischen den beiden Gruppen zu bewerten. Die Verteilung von H. pylori zwischen den Gruppen wurde unter Verwendung der Kolmogorov-Smirnov- und Shapiro-Wilk-Tests auf Normalität untersucht. Die Daten waren nicht normalverteilt, daher wurde die Veränderung der H. pylori-Zahlen innerhalb der Gruppe mit dem Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test bewertet und die Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit dem Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Der Spearman-Test wurde verwendet, um die Korrelation zwischen den H. pylori-Zahlen (1 x 103 Zellen/ml) in Plaque-/Speichelproben und den klinischen parodontalen Parametern zu Studienbeginn zu bestimmen. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 gesetzt. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) durchgeführt.