Wpływ pałeczek do żucia Miswak na doustne zakażenie Helicobacter pylori (Miswak)

Aspekty etyczne Protokół eksperymentu został zatwierdzony przez komitet etyczny Health Science Center (HSC) Uniwersytetu w Kuwejcie (VDR/ED/3331) i jest zarejestrowany na stronie ClinicalTrials.gov pod numerem NCT02418520 (16/04/2015). Badania prowadzono zgodnie z zasadami określonymi w deklaracji helsińskiej w sprawie eksperymentów medycznych na ludziach. Pisemną świadomą zgodę uzyskano od wszystkich uczestników i przedstawiono zgodnie ze skonsolidowanymi standardami zgłaszania badań (CONSORT).

Projekt badania Było to badanie eksperymentalne z randomizowanym, krzyżowym projektem z pojedynczą ślepą próbą.

Próba badana i gromadzenie danych To badanie zostało przeprowadzone wśród stałych pacjentów uczęszczających do Centrum Stomatologicznego na Uniwersytecie Kuwejckim w Kuwejcie. Rekrutacja pacjentów rozpoczęła się w lutym i zakończyła do końca sierpnia 2019 r. Pytanie PICO (P = Populacja pacjentów; I = Interwencja będąca przedmiotem zainteresowania; C = Interwencja porównawcza; O = Wynik) w tym badaniu brzmiało: „dla pacjentów w różnych warunkach na czczo (P), jaki jest efekt używania pałeczek do żucia miswak wraz z z użyciem szczoteczki do zębów (I) w porównaniu z używaniem samej szczoteczki do zębów (C) na liczbę H. pylori w jamie ustnej (O)?”. Pacjenci-wolontariusze zostali poinformowani o elementach badania i uzyskano od nich świadomą zgodę. Pobrano próbki śliny i płytki nazębnej do badań przesiewowych PCR w celu wykrycia obecności H. pylori. Kryteriami włączenia były: 1) osoby z wykrywalnym poziomem H. pylori w próbkach płytki nazębnej lub śliny; 2) brak cech zapalenia przyzębia; oraz 3) z co najmniej 24 zębami. Pacjenci, którzy otrzymywali antybiotykoterapię lub inhibitory pompy protonowej w ciągu ostatnich trzech miesięcy, zostali wykluczeni z badania.

Rekrutacja uczestników badania i grupowanie Do badania włączono 20 osób, które były na 12-godzinnym poście (grupa na czczo) oraz 20 osób, które nie pościły (grupa nie na czczo). Osoby nie będące na czczo rekrutowano między lutym a kwietniem, a grupy na czczo między majem a czerwcem 2018 r. (święty miesiąc Ramadan). Na początku badania (T0) każdemu pacjentowi przypisano numery na podstawie chronologicznej kolejności rejestracji w badaniu. Zarówno osoby na czczo, jak i nie na czczo zostały losowo podzielone na grupę 1 i grupę 2 (n=10 każda). Losowe przydzielanie badanych przeprowadzono przez losowy wynik binarny kości, liczby parzyste lub nieparzyste. Egzaminatorzy nie byli świadomi przydziału uczestników. Osoby z grupy 1 zostały poinstruowane, aby używały zarówno szczoteczki do zębów, jak i miswaka (TB+M) przez dwa tygodnie (T1) i tylko szczoteczki do zębów (TB) przez następne dwa tygodnie (T2); a osoby z grupy 2 zostały poproszone o stosowanie tylko gruźlicy podczas T1 i TB+M podczas T2, zarówno dla grup na czczo, jak i nie na czczo. Uczestnicy otrzymali instrukcje, jak używać miswak (chwyt pięcioma palcami, technika szorowania, przez 15 minut, dwa razy dziennie21) i TB (zmodyfikowana technika basu, przez dwie minuty, dwa razy dziennie) przez jednego badacza (JKB). Próbki płytki nazębnej i śliny pobrano w T0, T1 i T2.

Ankieta Z badanymi przeprowadzono wywiady i zebrano informacje na temat ich cech socjodemograficznych (wiek, płeć, wykształcenie, zatrudnienie i dochody), obecności wybranych schorzeń (nadciśnienie, cukrzyca i aktualne leki), palenia tytoniu oraz cech uzębienia (codzienna częstotliwość szczotkowania i poprzednia wizyta u dentysty).

Badanie kliniczne Na początku badania (T0) trzech przeszkolonych i skalibrowanych egzaminatorów przeprowadziło badania kliniczne przy użyciu lusterka ustnego i ręcznej sondy periodontologicznej (CP11 Hu Friedy, Europa), z pacjentem w pozycji półleżącej na fotelu dentystycznym (A-dec , Newberg, Oregon, USA). W badaniach klinicznych oceniono wskaźnik płytki nazębnej Silness & Löe (PI), wskaźnik dziąseł Löe & Silness (GI), kliniczną utratę przyczepu (CAL), głębokość zgłębnika (PD) oraz krwawienie przy zgłębnikowaniu (BOP) (inter/intra rzetelność egzaminatora >80%). Pomiary te przeprowadzono na sześciu powierzchniach (środkowo-językowej/podniebiennej, dystolingwalnej/podniebiennej, mezjalno-językowej/podniebiennej, dystalnej, środkowo-policzkowej i mezjalno-policzkowej) wszystkich zębów. Rejestrowano liczbę brakujących zębów.

Procedura pobierania próbek Próbki płytki nazębnej i śliny pobrano od pacjentów w T0, T1 i T2. Próbki płytki nazębnej pobrano ze szczeliny dziąsłowej przy najgłębszym odczycie kieszonkowym i usunięto z miejsca klinicznego za pomocą sterylnej uniwersalnej kirety. Obszar pobierania próbek izolowano za pomocą wyrzutników śliny i delikatnie suszono powietrzem. Końcówkę kirety wprowadzano w głąb szczeliny/kieszonki, przesuwając dokoronowo w kontakcie z powierzchnią zęba, w celu usunięcia płytki nazębnej zarówno pod, jak i naddziąsłowej. Następnie próbki zanurzono w 0,5 ml sterylnej wody destylowanej w probówkach Eppendorfa (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy). W celu pobrania stymulowanych próbek śliny, osoby badane proszono o żucie wosku parafinowego i odkrztuszanie do plastikowego lejka połączonego z cylindrem miarowym. Od każdej osoby pobrano około 3 ml śliny. Natychmiast po pobraniu probówki z próbkami umieszczono w pojemniku wypełnionym kruszonym lodem i przetransportowano do laboratorium mikrobiologii jamy ustnej w celu zakonserwowania w temperaturze -80°C.

Hodowlę bakterii H. pylori szczep JA1 uzyskano z Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu KUWAIT. Szczep bakterii hodowano na agarze tryptozowo-sojowym uzupełnionym odwłóknioną krwią baranią (5%) w temperaturze 37°C w warunkach mikroaerofilnych.

Oczyszczanie DNA Próbki śliny i płytki przeniesiono do laboratorium na lodzie. Po worteksowaniu przez 1 minutę przy 12000 x g supernatant usunięto, a osady przechowywano w temperaturze -80°C. DNA z peletek oczyszczono stosując zestaw do oczyszczania DNA DNeasy (Qiagen, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, peletki traktowano buforem do lizy i proteinazą-K w 56 stopniach Celsjusza przez 1 godzinę. DNA z zlizowanych próbek naniesiono na kolumnę wirówkową i przemyto. Oczyszczone DNA eluowano wodą wolną od nukleaz, a stężenia DNA mierzono metodą spektrofotometrii UV przy użyciu NanoDropTM 1000. Genomowy DNA z H. pylori JA1 oczyszczono stosując tę ​​samą metodę.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) Po oczyszczeniu DNA z próbek zmierzono ilości H. pylori metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym SYBR Green przy użyciu specyficznych dla gatunku starterów H. pylori dla genu ureA: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' i ureA-R: 5'-GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. Mieszanina reakcyjna qPCR (25 µl) zawierała 12,5 µl mieszanki głównej SYBR Green (zestaw Power SYBR Green®, Applied Biosystems), po 1,0 µl startera do przodu i do tyłu (0,4 µM), 5,0 µl matrycy DNA i 5,5 µl H2O. Profil termiczny był następujący: początkowa denaturacja w 95°C przez 10 min, 40 cykli w 95°C przez 15-30 s, 55°C przez 30 s i 72°C przez 30 s. Akwizycję sygnału fluorescencyjnego ustawiono na etapie wydłużania każdego cyklu. Wszystkie reakcje qPCR przeprowadzono na urządzeniu ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR. Do analizy danych zastosowano systemy wykrywania sekwencji (SDS) (wersja oprogramowania 2.3). Seryjnie rozcieńczony genomowy DNA z H. pylori JA1 wykorzystano w reakcjach do wykreślenia wartości Ct w funkcji wydedukowanego stężenia komórek bakteryjnych (komórek/ml) dla każdego gatunku i do skonstruowania krzywych wzorcowych przy użyciu powyższego oprogramowania. Wszystkie pomiary wykonano w trzech powtórzeniach dla próbek, wzorców i kontroli.

Zarządzanie danymi i analiza statystyczna Zmniejszenie liczby H. pylori za pomocą TB+M lub TB w różnych warunkach na czczo było głównym wynikiem zainteresowania tego badania. Ponieważ nie były dostępne żadne informacje a priori na temat wpływu miswak na H. pylori, wielkość próby obliczono tak, aby wykryć 50% różnicę między grupami, zakładając średnią redukcję liczby H. pylori o 30% między grupami, z odchyleniem standardowym 15%. Aby uzyskać moc 80% i alfa ryzyka 0,05, wymaganych było 17 pacjentów na grupę, co zostało zaokrąglone do 20, aby uwzględnić wszelkie potencjalne wypadki. Różnice w liczbie drobnoustrojów obliczono między T0, T1 i T2. Do oceny różnic w charakterystyce ogólnej między obiema grupami wykorzystano test U Manna-Whitneya lub Kruskala-Wallisa (ciągła zmienna zależna) oraz test chi-kwadrat (kategoryczna zmienna zależna). Rozkład H. pylori między grupami zbadano pod kątem normalności za pomocą testów Kołmogorowa-Smirnowa i Shapiro-Wilka. Dane nie miały rozkładu normalnego, więc wewnątrzgrupową zmianę liczby H. pylori oceniono za pomocą testu rang podpisanego Wilcoxona, a porównań międzygrupowych dokonano za pomocą testu U Manna-Whitneya. Do oceny korelacji między liczbą komórek H. pylori (1x103 komórek/ml) w próbkach płytki nazębnej/śliny a wyjściowymi parametrami klinicznymi przyzębia zastosowano test Spearmana. Poziom istotności ustalono na p<0,05. Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).