미스왁 츄잉스틱이 구강 Helicobacter Pylori 감염에 미치는 영향 (Miswak)

윤리적 측면 실험 프로토콜은 쿠웨이트 대학의 건강 과학 센터(HSC) 윤리 위원회(VDR/ED/3331)의 승인을 받았으며 ClinicalTrials.gov에 NCT02418520(2015년 4월 16일)으로 등록되었습니다. 연구는 인체 의학 실험에 관한 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 수행되었습니다. 모든 참가자로부터 서면 동의서를 얻었으며 CONSORT(통합 보고 시험 기준) 지침에 따라 제시되었습니다.

연구 설계 이것은 무작위, 교차, 단일 맹검 설계를 사용한 실험적 연구였습니다.

연구 샘플 및 데이터 수집 본 연구는 쿠웨이트 대학 치과 센터에 다니는 정규 환자를 대상으로 수행되었습니다. 환자 모집은 2월에 시작되어 2019년 8월 말에 완료되었습니다. 이 연구에 대한 PICO(P = 환자 모집단, I = 관심 개입, C = 비교 개입, O = 결과) 질문은 "서로 다른 단식 조건(P)에 있는 피험자에 대해 칫솔 사용(I) 대 칫솔만 사용(C) 구강 H. pylori 수치(O)?". 자원 봉사 환자는 연구 구성 요소에 대해 브리핑을 받았고 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. H. pylori의 존재를 검출하기 위한 PCR 스크리닝을 위해 침과 플라크 샘플을 수집했습니다. 포함 기준은 다음과 같습니다: 1) 플라크 또는 타액 샘플에서 검출 가능한 수준의 H. pylori를 가진 대상 2) 치주염의 증거가 없음; 3) 치아가 24개 이상인 경우. 최근 3개월 이내에 항생제 치료 또는 양성자 펌프 억제제를 투여받은 피험자는 연구에서 제외되었습니다.

연구 참여자 모집 및 그룹화 이 연구에는 12시간 단식을 하는 20명의 피험자(단식 그룹)와 단식을 하지 않는 20명의 피험자(비단식 그룹)가 포함되었습니다. 비단식 그룹 대상은 2월과 4월 사이에 모집되었고 단식 그룹 대상은 2018년 5월과 6월(라마단 성월) 사이에 모집되었습니다. 기준선(T0)에서 각 피험자는 연구 등록 시간순에 따라 번호가 지정되었습니다. 단식 및 비단식 피험자 모두 무작위로 그룹 1과 그룹 2로 세분되었습니다(각각 n=10). 주제의 무작위 할당은 주사위, 짝수 또는 홀수의 무작위 이진 결과에 의해 수행되었습니다. 심사관은 참가자 할당을 인식하지 못했습니다. 그룹 1 피험자는 2주(T1) 동안 칫솔과 미스왁(TB+M)을 모두 사용하고 다음 2주(T2) 동안 칫솔만(TB) 사용하도록 지시받았습니다. 그룹 2 대상자는 단식 그룹과 비단식 그룹 모두에 대해 T1 동안 TB만 사용하고 T2 동안 TB+M을 사용하도록 요청받았습니다. 참가자들은 단일 조사관(JKB)에 의해 미스왁(5개의 손가락 그립, 스크럽 기술, 15분 동안, 하루에 두 번21) 및 TB(수정된 베이스 기술, 2분 동안, 하루에 두 번)를 사용하는 방법에 대한 지침을 받았습니다. 플라크 및 타액 샘플은 T0, T1 및 T2에서 수집되었습니다.

설문 대상자를 인터뷰하고 사회 인구학적 특성(연령, 성별, 교육, 고용 및 소득), 선택된 의학적 상태(고혈압, 당뇨병 및 현재 약물), 흡연 상태 및 치아 특성(매일 칫솔질 빈도)에 대한 정보를 수집했습니다. 및 이전 치과 방문).

임상 검사 기준선(T0)에서 세 명의 훈련되고 보정된 검사자가 치과용 의자(A-dec , Newberg, OR, 미국). 임상 검사는 Silness & Löe 플라크 지수(PI), Löe & Silness 치은 지수(GI), 임상 부착 손실(CAL), 탐침 깊이(PD) 및 탐침 시 출혈(BOP)(간/내)을 평가했습니다. 심사관 신뢰도 >80%). 이러한 측정은 모든 치아의 6개 표면(중설측/구개측, 원위설측/구개측, 근심설측/구개측, distobuccal, midbuccal 및 mesioboccal)에서 수행되었습니다. 누락된 치아의 수를 기록했습니다.

샘플 수집 절차 T0, T1 및 T2에서 피험자로부터 플라크 및 타액 샘플을 수집했습니다. 플라크 샘플은 가장 깊은 포켓 판독에서 치은 틈새에서 채취하고 멸균 범용 큐렛을 사용하여 임상 부위에서 제거했습니다. 샘플링 영역은 타액 배출기를 사용하여 분리하고 공기로 부드럽게 건조했습니다. 큐렛의 끝을 틈새/주머니의 깊이에 삽입하고 치아 표면과 접촉하면서 관상 방향으로 이동하여 치은연하 플라크와 치은연상 플라크를 모두 제거했습니다. 그런 다음 샘플을 Eppendorf 튜브(epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Germany)의 멸균 증류수 0.5ml에 담급니다. 자극된 타액 샘플을 수집하기 위해 피험자는 파라핀 왁스를 씹도록 요청받았고 등급이 매겨진 측정 실린더에 연결된 플라스틱 깔때기로 뱉어냈습니다. 각 피험자로부터 약 3ml의 타액을 채취했습니다. 수집 직후 샘플 튜브를 부순 얼음으로 채워진 용기에 넣고 -800C에서 보존하기 위해 Oral Microbiology 실험실로 옮겼습니다.

박테리아 배양 H. pylori JA1 균주는 KUWAIT University 의학부에서 입수했습니다. 박테리아 균주는 미호기성 조건에서 섭씨 37도에서 섬유소가 제거된 양 혈액(5%)이 보충된 트립티카제 대두 한천에서 성장했습니다.

DNA 정제 타액과 플라크 샘플을 얼음 위에 담아 실험실로 가져왔습니다. 12000 x g에서 1분 동안 vortex한 후 상등액을 제거하고 펠릿을 -80°C에서 보관했습니다. 펠릿의 DNA는 DNeasy DNA Purification Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 정제했습니다. 간략하게, 펠릿을 용해 완충액 및 프로테이나제-K로 섭씨 56도에서 1시간 동안 처리하였다. 용해된 샘플의 DNA를 스핀 컬럼에 적용하고 세척했습니다. 정제된 DNA는 nuclease free water를 이용하여 용출하였고, DNA 농도는 NanoDropTM 1000을 이용한 UV spectrophotometry 방법으로 측정하였다. 동일한 방법을 사용하여 H. pylori JA1의 게놈 DNA를 정제하였다.

Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) 시료로부터 DNA를 정제한 후, ureA 유전자에 대한 H. pylori 종 특이 프라이머: ureA-F를 사용하여 SYBR Green 정량적 실시간 PCR 방법으로 H. pylori의 양을 측정하였다. : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' 및 ureA-R: 5'-GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. qPCR 반응 혼합물(25µl)에는 12.5µl SYBR Green 마스터 믹스(Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1.0µl(0.4µM), 5.0µl DNA 템플릿 및 5.5µl H2O가 포함되어 있습니다. 열 프로필은 다음과 같습니다: 95°C에서 10분 동안 초기 변성, 95°C에서 15-30초, 55°C에서 30초 및 72°C에서 30초의 40주기. 형광 신호 획득은 각 사이클의 신장 단계에서 설정되었습니다. 모든 qPCR 반응은 ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR 기계에서 실행되었습니다. SDS(Sequence Detection System)(소프트웨어 버전 2.3)를 데이터 분석에 사용했습니다. H. pylori JA1의 연속 희석된 genomic DNA는 위의 소프트웨어를 사용하여 각 종에 대한 추론된 박테리아 세포 농도(cells/mL)에 대한 Ct 값을 플로팅하고 표준 곡선을 작성하기 위한 반응에 사용되었습니다. 모든 측정은 샘플, 표준 및 대조군에 대해 세 번 수행되었습니다.

데이터 관리 및 통계 분석 다양한 금식 조건에서 TB+M 또는 TB를 사용하여 H. pylori 수의 감소가 이 연구의 주요 관심 결과였습니다. H. pylori에 대한 miswak의 영향에 대한 선험적 정보가 없었기 때문에 샘플 크기는 그룹 간 H. pylori 수가 평균 30% 감소했다고 가정하고 표준 편차를 사용하여 그룹 간 50% 차이를 감지하도록 계산되었습니다. 15%. 80%의 검정력과 0.05의 위험 알파를 얻으려면 그룹당 17명의 환자가 필요했으며 잠재적인 탈락을 설명하기 위해 20으로 반올림했습니다. 미생물 수의 차이는 T0, T1 및 T2 사이에서 계산되었습니다. Mann-Whitney U-test 또는 Kruskal-Wallis test(연속 종속 변수) 및 카이 제곱 검정(범주 종속 변수)을 사용하여 두 그룹 간의 일반적인 특성 차이를 평가했습니다. 그룹 간의 H. pylori 분포는 Kolmogorov-Smirnov 및 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 정규성을 조사했습니다. 데이터가 정상적으로 분포되지 않았으므로 Wilcoxon signed rank test로 H. pylori 수의 그룹 내 변화를 평가하고 Mann-Whitney U-test를 사용하여 그룹 간 비교를 수행했습니다. Spearman's test는 플라크/타액 샘플의 H. pylori 수치(1x103cells/mL)와 기준선에서의 임상 치주 매개변수 사이의 상관관계를 평가하는 데 사용되었습니다. 유의 수준은 p<0.05로 설정되었습니다. 모든 통계 분석은 SPSS 26.0(IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 사용하여 수행하였다.