L'effet des bâtonnets à mâcher Miswak sur l'infection orale à Helicobacter Pylori (Miswak)

Aspects éthiques Le protocole expérimental a été approuvé par le comité d'éthique du Centre des sciences de la santé (HSC) de l'Université du Koweït (VDR/ED/3331) et est enregistré sur ClinicalTrials.gov sous le numéro NCT02418520 (16/04/2015). La recherche a été menée selon les principes énoncés dans la déclaration d'Helsinki sur l'expérimentation médicale humaine. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants et est présenté conformément aux directives des normes consolidées de notification des essais (CONSORT).

Conception de l'étude Il s'agissait d'une étude expérimentale avec une conception randomisée, croisée et en simple aveugle.

Échantillon de l'étude et collecte des données Cette étude a été menée auprès de patients réguliers fréquentant le centre dentaire de l'Université du Koweït, au Koweït. Le recrutement des patients a commencé en février et s'est terminé fin août 2019. La question PICO (P = Population de patients ; I = Intervention d'intérêt ; C = Intervention comparative ; O = Résultat) pour cette étude était : "pour les sujets soumis à différentes conditions de jeûne (P), quel est l'effet de l'utilisation de bâtonnets à mâcher miswak avec une brosse à dents (I) versus utiliser uniquement une brosse à dents (C) sur le décompte oral de H. pylori (O) ?". Les patients volontaires ont été informés des composants de l'étude et un consentement éclairé a été obtenu de leur part. Des échantillons de salivaire et de plaque ont été prélevés pour un dépistage par PCR afin de détecter la présence de H. pylori. Les critères d'inclusion étaient les suivants : 1) sujets présentant des niveaux détectables de H. pylori dans des échantillons de plaque ou de salive ; 2) aucun signe de parodontite ; et, 3) avec au moins 24 dents. Les sujets ayant reçu une antibiothérapie ou des inhibiteurs de la pompe à protons au cours des trois derniers mois ont été exclus de l'étude.

Recrutement des participants à l'étude et regroupement Cette étude a inclus 20 sujets qui étaient à jeun depuis 12 heures (groupe à jeun) et 20 sujets qui n'étaient pas à jeun (groupe non à jeun). Les sujets du groupe non à jeun ont été recrutés entre février et avril et les sujets du groupe à jeun ont été recrutés entre mai et juin 2018 (mois sacré du Ramadan). Au départ (T0), chaque sujet s'est vu attribuer des numéros en fonction de l'ordre chronologique d'inscription à l'étude. Les sujets à jeun et non à jeun ont été subdivisés au hasard en groupe 1 et groupe 2 (n = 10 chacun). L'assignation randomisée des sujets a été réalisée par un résultat binaire aléatoire d'un dé, pair ou impair. Les examinateurs n'ont pas été informés de l'attribution des participants. Les sujets du groupe 1 ont reçu pour instruction d'utiliser à la fois une brosse à dents et un miswak (TB+M) pendant deux semaines (T1) et uniquement une brosse à dents (TB) pendant les deux semaines suivantes (T2) ; et, les sujets du groupe 2 ont été invités à utiliser uniquement TB pendant T1 et TB + M pendant T2, à la fois pour les groupes à jeun et non à jeun. Les participants ont reçu des instructions sur la façon d'utiliser le miswak (prise à cinq doigts, technique de frottement, pendant 15 minutes, deux fois par jour21) et la tuberculose (technique de Bass modifiée, pendant deux minutes, deux fois par jour) par un seul enquêteur (JKB). Des échantillons de plaque et de salivaire ont été prélevés à T0, T1 et T2.

Questionnaire Les sujets ont été interrogés et des informations ont été recueillies sur leurs caractéristiques sociodémographiques (âge, sexe, éducation, emploi et revenu), la présence de certaines conditions médicales (hypertension, diabète et médicaments actuels), le statut tabagique et les caractéristiques dentaires (fréquence de brossage quotidienne et visite dentaire précédente).

Examen clinique Au départ (T0), trois examinateurs formés et calibrés ont effectué les examens cliniques à l'aide d'un miroir buccal et d'une sonde parodontale manuelle (CP11 Hu Friedy, Europe), le patient étant en position semi-couchée sur le fauteuil dentaire (A-dec , Newberg, OR, États-Unis). Les examens cliniques ont évalué l'indice de plaque Silness & Löe (PI), l'indice gingival Löe & Silness (GI), la perte d'attache clinique (CAL), la profondeur de sondage (PD) et le saignement au sondage (BOP) (inter/intra fiabilité de l'examinateur > 80 %). Ces mesures ont été effectuées sur six surfaces (médiolinguale/palatine, distolinguale/palatine, mésiolinguale/palatine, distobuccale, médiobuccale et mésiobuccale) de toutes les dents. Le nombre de dents manquantes a été enregistré.

Procédure de prélèvement des échantillons Des échantillons de plaque et de salive ont été prélevés sur les sujets à T0, T1 et T2. Des échantillons de plaque ont été prélevés dans la crevasse gingivale lors de la lecture de la poche la plus profonde et retirés du site clinique à l'aide d'une curette universelle stérile. La zone d'échantillonnage a été isolée à l'aide d'éjecteurs salivaires et séchée doucement à l'air. La pointe de la curette a été insérée dans les profondeurs de la crevasse/poche, déplacée coronairement tout en étant en contact avec la surface de la dent, pour éliminer à la fois la plaque sous et supragingivale. Les échantillons ont ensuite été immergés dans 0,5 ml d'eau distillée stérile dans des tubes Eppendorf (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hambourg, Allemagne). Pour la collecte d'échantillons salivaires stimulés, les sujets ont été invités à mâcher de la cire de paraffine et à cracher dans un entonnoir en plastique relié à un cylindre de mesure gradué. Environ 3 ml de salive ont été prélevés sur chaque sujet. Immédiatement après la collecte, les tubes d'échantillons ont été placés dans un récipient rempli de glace pilée et transportés au laboratoire de microbiologie orale pour être conservés à -80°C.

Culture bactérienne La souche H. pylori JA1 a été obtenue auprès de la Faculté de médecine de l'Université du KOWEIT. La souche bactérienne a été cultivée sur de la gélose trypticase soja additionnée de sang de mouton défibriné (5%) à 37 degrés Celsius dans des conditions microaérophiles.

Purification de l'ADN Des échantillons de salive et de plaque ont été apportés au laboratoire sur de la glace. Après agitation au vortex pendant 1 minute à 12 000 x g, le surnageant a été éliminé et les culots ont été stockés à -80°C. L'ADN des pastilles a été purifié en utilisant un kit de purification d'ADN DNeasy (Qiagen, Allemagne) conformément aux instructions du fabricant. En bref, les culots ont été traités avec du tampon de lyse et de la protéinase-K à 56 degrés Celsius pendant 1 h. L'ADN des échantillons lysés a été appliqué sur une colonne de centrifugation et lavé. L'ADN purifié a été élué à l'aide d'eau sans nucléase et les concentrations d'ADN ont été mesurées par la méthode de spectrophotométrie UV à l'aide de NanoDropTM 1000. L'ADN génomique de H. pylori JA1 a été purifié en utilisant la même méthode.

Réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR) Après purification de l'ADN des échantillons, les quantités de H. pylori ont été mesurées par la méthode de PCR quantitative en temps réel SYBR Green en utilisant des amorces spécifiques à l'espèce H. pylori pour le gène ureA : ureA-F : 5'-CGTGGCAGCATGATCCAT-3' et ureA-R : 5'-GGGTATGCAGGTTACGAGTTT-3' 44. Le mélange réactionnel qPCR (25 µl) contenait 12,5 µl de mélange maître SYBR Green (Kit Power SYBR Green®, Applied Biosystems), 1,0 µl d'amorce directe et inverse (0,4 µM), 5,0 µl de matrice d'ADN et 5,5 µl de H2O. Le profil thermique était le suivant : une dénaturation initiale à 95°C pendant 10min, 40 cycles de 95°C pendant 15-30s, 55°C pendant 30s et 72°C pendant 30s. L'acquisition du signal fluorescent a été réglée à l'étape d'allongement de chaque cycle. Toutes les réactions qPCR ont été effectuées sur une machine de PCR en temps réel ABpplied Biosystems® Fast 7500. Sequence Detection Systems (SDS) (version logicielle 2.3) a été utilisé pour l'analyse des données. L'ADN génomique dilué en série de H. pylori JA1 a été utilisé pour tracer les valeurs de Ct par rapport à la concentration de cellules bactériennes déduite (cellules/mL) pour chaque espèce et pour construire des courbes standard à l'aide du logiciel ci-dessus. Toutes les mesures ont été prises en triple pour les échantillons, les standards et les contrôles.

Gestion des données et analyse statistique Une réduction du nombre de H. pylori en utilisant soit TB+M soit TB dans différentes conditions de jeûne était le principal résultat d'intérêt dans cette étude. Comme aucune information a priori sur l'effet du miswak sur H. pylori n'était disponible, la taille de l'échantillon a été calculée pour détecter une différence de 50 % entre les groupes, en supposant une réduction moyenne de 30 % du nombre de H. pylori entre les groupes, avec un écart type de 15 %. Pour obtenir une puissance de 80 % et pour un alpha de risque de 0,05, il fallait 17 patients par groupe, arrondi à 20 pour tenir compte des éventuels abandons. La différence dans les comptages microbiens a été calculée entre T0, T1 et T2. Le test U de Mann-Whitney ou le test de Kruskal-Wallis (variable dépendante continue) et le test du chi carré (variable dépendante catégorielle) ont été utilisés pour évaluer les différences dans les caractéristiques générales entre les deux groupes. La distribution de H. pylori entre les groupes a été explorée pour la normalité en utilisant les tests de Kolmogorov-Smirnov et Shapiro-Wilk. Les données n'étaient pas distribuées normalement, de sorte que la variation intragroupe du nombre de H. pylori a été évaluée avec le test de rang signé de Wilcoxon et les comparaisons intergroupes ont été effectuées à l'aide du test U de Mann-Whitney. Le test de Spearman a été utilisé pour évaluer la corrélation entre les numérations de H. pylori (1x103cellules/mL) dans les échantillons de plaque/salivaire et les paramètres parodontaux cliniques au départ. Le seuil de signification a été fixé à p<0,05. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).