Vliv žvýkacích tyčinek Miswak na orální infekci Helicobacter pylori (Miswak)

Etické aspekty Experimentální protokol byl schválen etickou komisí Health Science Center (HSC) Kuvajtské univerzity (VDR/ED/3331) a je registrován na ClinicalTrials.gov jako NCT02418520 (16. 4. 2015). Výzkum byl prováděn podle zásad uvedených v Helsinské deklaraci o lékařských experimentech na lidech. Od všech účastníků byl získán písemný informovaný souhlas, který je prezentován v souladu s pokyny pro konsolidované standardy pro podávání zpráv (CONSORT).

Design studie Jednalo se o experimentální studii s randomizovaným, zkříženým, jednoduše slepým designem.

Vzorek studie a sběr dat Tato studie byla provedena mezi běžnými pacienty navštěvujícími Dental Center na Kuwait University, Kuwait. Nábor pacientů začal v únoru a byl dokončen do konce srpna 2019. Otázka PICO (P = populace pacientů; I = zájmová intervence; C = srovnávací intervence; O = výsledek) pro tuto studii zněla: „Jaký je účinek používání žvýkacích tyčinek miswak u subjektů za různých podmínek nalačno (P). se zubním kartáčkem (I) versus používání pouze zubního kartáčku (C) na orální počty H. pylori (O)?". Dobrovolní pacienti byli informováni o složkách studie a byl od nich získán informovaný souhlas. Vzorky slin a plaků byly odebrány pro PCR screening pro detekci přítomnosti H. pylori. Kritéria pro zařazení byla: 1) subjekty s detekovatelnými hladinami H. pylori buď ve vzorcích plaku nebo slin; 2) žádné známky parodontitidy; a 3) s alespoň 24 zuby. Subjekty, které dostávaly antibiotickou terapii nebo inhibitory protonové pumpy během posledních tří měsíců, byly ze studie vyloučeny.

Nábor účastníků studie a seskupování Tato studie zahrnovala 20 subjektů, které byly na 12hodinovém lačnění (skupina nalačno) a 20 subjektů, které nehladovaly (skupina bez půstu). Subjekty ve skupině bez půstu byly rekrutovány mezi únorem a dubnem a subjekty ve skupině s půstem byly rekrutovány mezi květnem a červnem 2018 (svatý měsíc ramadán). Na začátku (TO) byla každému subjektu přidělena čísla na základě chronologického pořadí zařazení do studie. Jak lační, tak nehladující subjekty byly náhodně rozděleny do skupiny 1 a skupiny 2 (n=10 každá). Náhodné přiřazení subjektů bylo provedeno náhodným binárním výsledkem kostky, sudých nebo lichých čísel. Zkoušející nevěděli o přidělení účastníků. Subjekty skupiny 1 byly instruovány, aby používaly jak zubní kartáček, tak miswak (TB+M) po dobu dvou týdnů (T1) a pouze zubní kartáček (TB) po další dva týdny (T2); a subjekty skupiny 2 byly požádány, aby užívaly pouze TB během T1 a TB+M během T2, a to jak pro skupiny nalačno, tak skupiny bez hladovění. Účastníci dostali instrukce, jak používat miswak (stisk pěti prstů, technika drhnutí, po dobu 15 minut, dvakrát denně21) a TB (upravená Bassova technika, po dobu dvou minut, dvakrát denně) jediným výzkumníkem (JKB). Vzorky plaku a slin byly odebrány v T0, T1 a T2.

Dotazník Byly provedeny rozhovory a byly shromážděny informace o jejich sociodemografických charakteristikách (věk, pohlaví, vzdělání, zaměstnání a příjem), přítomnosti vybraných zdravotních potíží (hypertenze, cukrovka a současné léky), kouření a charakteristikách zubů (denní frekvence čištění zubů). a předchozí návštěva zubaře).

Klinické vyšetření Na začátku (T0) provedli tři vyškolení a kalibrovaní vyšetřovatelé klinická vyšetření pomocí ústního zrcátka a ruční periodontální sondy (CP11 Hu Friedy, Evropa), přičemž pacient byl v pololeže na stomatologickém křesle (A-dec , Newberg, OR, USA). Klinická vyšetření hodnotila Silness & Löe plak index (PI), Löe & Silness gingivální index (GI), klinickou ztrátu přilnutí (CAL), hloubku sondování (PD) a krvácení při sondování (BOP) (inter/intra spolehlivost zkoušejícího > 80 %). Tato měření byla provedena na šesti površích (midlingvální/palatinální, distolingvální/palatinový, mesiolingvální/palatinový, distobukální, midbukální a meziobukální) všech zubů. Byl zaznamenán počet chybějících zubů.

Postup odběru vzorků Vzorky plaku a slin byly odebrány subjektům v T0, T1 a T2. Vzorky plaku byly odebrány z gingivální štěrbiny při čtení nejhlubší kapsy a odstraněny z klinického místa pomocí sterilní univerzální kyrety. Oblasti odběru vzorků byly izolovány pomocí slinných ejektorů a jemně vysušeny vzduchem. Špička kyrety byla vložena do hloubky štěrbiny/kapsy, posunuta koronálně, zatímco byla v kontaktu s povrchem zubu, aby se odstranil jak sub- a supragingivální plak. Vzorky byly poté ponořeny do 0,5 ml sterilní destilované vody ve zkumavkách Eppendorf (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Německo). Pro odběr stimulovaných vzorků slin byly subjekty požádány, aby žvýkaly parafínový vosk a vykašlávaly do plastové nálevky spojené s odstupňovaným odměrným válcem. Od každého subjektu byly odebrány asi 3 ml slin. Ihned po odběru byly zkumavky se vzorky umístěny do nádoby naplněné drceným ledem a přepraveny do laboratoře orální mikrobiologie pro uchování při -80 °C.

Bakteriální kultura H. pylori kmen JA1 byla získána z lékařské fakulty KUWAIT University. Bakteriální kmen byl pěstován na tryptikázovém sojovém agaru doplněném defibrinovanou ovčí krví (5 %) při 37 stupních Celsia v mikroaerofilních podmínkách.

Čištění DNA Vzorky slin a plaků byly přeneseny do laboratoře na ledu. Po vortexování po dobu 1 minuty při 12 000 x g byl supernatant odstraněn a pelety byly skladovány při -80 °C. DNA z pelet byla purifikována pomocí DNeasy DNA purification Kit (Qiagen, Německo) podle instrukcí výrobce. Stručně, pelety byly ošetřeny lyzačním pufrem a proteinázou-K při 56 stupních Celsia po dobu 1 hodiny. DNA z lyžovaných vzorků byla nanesena na rotační kolonu a promyta. Purifikovaná DNA byla eluována vodou bez nukleázy a koncentrace DNA byly měřeny metodou UV spektrofotometrie s použitím NanoDropTM 1000. Genomová DNA z H. pylori JA1 byla purifikována za použití stejné metody.

Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) Po přečištění DNA ze vzorků byla množství H. pylori měřena kvantitativní metodou PCR v reálném čase SYBR Green s použitím druhově specifických primerů H. pylori pro gen ureA: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' a ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. Reakční směs qPCR (25 µl) obsahovala 12,5 µl hlavní směsi SYBR Green (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 1,0 µl dopředného a zpětného primeru (0,4 µM), 5,0 µl templátu DNA a 5,5 µl H2O. Tepelný profil byl následující: počáteční denaturace při 95 °C po dobu 10 minut, 40 cyklů při 95 °C po dobu 15-30 s, 55 °C po dobu 30 s a 72 °C po dobu 30 s. Získávání fluorescenčního signálu bylo nastaveno v kroku prodloužení každého cyklu. Všechny reakce qPCR byly prováděny na přístroji ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR. Pro analýzu dat byl použit Sequence Detection Systems (SDS) (verze softwaru 2.3). Sériově naředěná genomová DNA z H. pylori JA1 byla použita jako reakce pro vynesení hodnot Ct proti odvozené koncentraci bakteriálních buněk (buňky/ml) pro každý druh a pro konstrukci standardních křivek s použitím výše uvedeného softwaru. Všechna měření byla provedena trojmo pro vzorky, standardy a kontroly.

Správa dat a statistická analýza Snížení počtu H. pylori s použitím buď TB+M nebo TB za různých podmínek nalačno bylo primárním výsledkem zájmu této studie. Protože nebyly k dispozici žádné a priori informace o účinku miswaku na H. pylori, byla velikost vzorku vypočtena tak, aby detekovala 50% rozdíl mezi skupinami, za předpokladu průměrného 30% snížení počtu H. pylori mezi skupinami se standardní odchylkou 15 %. K získání síly 80 % a pro riziko alfa 0,05 bylo zapotřebí 17 pacientů na skupinu, což bylo zaokrouhleno na 20, aby se zohlednily všechny potenciální výpadky. Rozdíl v počtech mikrobů byl vypočítán mezi T0, T1 a T2. K posouzení rozdílů v obecných charakteristikách mezi těmito dvěma skupinami byly použity Mann-Whitney U-test nebo Kruskal-Wallisův test (kontinuální závislá proměnná) a chí-kvadrát test (kategoriálně závislá proměnná). Distribuce H. pylori mezi skupinami byla zkoumána z hlediska normality pomocí Kolmogorov-Smirnovových a Shapiro-Wilkových testů. Data nebyla normálně distribuována, takže vnitroskupinová změna v počtu H. pylori byla hodnocena Wilcoxonovým znaménkovým rank testem a meziskupinová srovnání byla provedena pomocí Mann-Whitneyho U-testu. Spearmanův test byl použit k posouzení korelace mezi počty H. pylori (1x103 buněk/ml) ve vzorcích plaku/slin a klinickými periodontálními parametry na začátku. Hladina významnosti byla nastavena na p<0,05. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).