Virkningen af ​​Miswak-tyggepinde på den orale Helicobacter Pylori-infektion (Miswak)

Etiske aspekter Den eksperimentelle protokol blev godkendt af Health Science Center (HSC) etiske udvalg ved Kuwait University (VDR/ED/3331) og er registreret på ClinicalTrials.gov som NCT02418520 (16/04/2015). Forskningen blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen om humane medicinske eksperimenter. Skriftligt informeret samtykke blev indhentet fra alle deltagere og præsenteres i overensstemmelse med retningslinjerne for konsoliderede standarder for rapportering af forsøg (CONSORT).

Undersøgelsesdesign Dette var en eksperimentel undersøgelse med et randomiseret, cross-over, enkeltblindt design.

Undersøgelsesprøve og dataindsamling Denne undersøgelse blev udført blandt almindelige patienter, der går på tandlægecentret ved Kuwait University, Kuwait. Patientrekruttering startede i februar og blev afsluttet ved udgangen af ​​august 2019. PICO (P = Patientpopulation; I = Intervention af interesse; C = Komparativ intervention; O = Outcome) spørgsmålet for denne undersøgelse var, "for forsøgspersoner under forskellige fasteforhold (P), hvad er effekten af ​​at bruge miswak tyggepinde sammen med tandbørste (I) versus kun at bruge tandbørste (C) på de orale H. pylori-tællinger (O)?". Frivillige patienter blev orienteret om undersøgelsens komponenter, og der blev indhentet informeret samtykke fra dem. Spyt- og plakprøver blev indsamlet til PCR-screening for at påvise tilstedeværelsen af ​​H. pylori. Inklusionskriterierne var: 1) forsøgspersoner med påviselige niveauer af H. pylori i enten plak- eller spytprøver; 2) ingen tegn på paradentose; og 3) med mindst 24 tænder. Forsøgspersoner, der modtog antibiotikabehandling eller protonpumpehæmmere inden for de seneste tre måneder, blev udelukket fra undersøgelsen.

Rekruttering af undersøgelsesdeltagere og gruppering Denne undersøgelse omfattede 20 forsøgspersoner, der var på 12-timers faste (fastende gruppe) og 20 forsøgspersoner, der ikke fastede (ikke-fastende gruppe). Ikke-fastende gruppepersoner blev rekrutteret mellem februar og april, og fastende gruppepersoner blev rekrutteret mellem maj og juni 2018 (den hellige måned Ramadan). Ved baseline (T0) blev hvert individ tildelt numre baseret på den kronologiske rækkefølge af tilmelding i undersøgelsen. Både de fastende og de ikke-fastende forsøgspersoner blev tilfældigt opdelt i gruppe-1 og gruppe-2 (n=10 hver). Randomiseret tildeling af forsøgspersonerne blev udført ved et tilfældigt binært udfald af en terning, lige eller ulige tal. Censorerne blev holdt uvidende om deltagertildelingen. Gruppe-1 forsøgspersoner blev instrueret i at bruge både tandbørste og miswak (TB+M) i to uger (T1) og kun tandbørste (TB) i de næste to uger (T2); og gruppe-2-personer blev bedt om kun at bruge TB under T1 og TB+M under T2, både for de fastende og de ikke-fastende grupper. Deltagerne fik instruktioner om, hvordan man bruger miswak (fem fingergreb, skrubbeteknik, i 15 minutter, to gange dagligt21) og TB (modificeret basteknik, i to minutter, to gange dagligt) af en enkelt investigator (JKB). Plak- og spytprøver blev opsamlet ved T0, T1 og T2.

Spørgeskema Forsøgspersonerne blev interviewet, og der blev indsamlet information om deres socio-demografiske karakteristika (alder, køn, uddannelse, beskæftigelse og indkomst), tilstedeværelse af udvalgte medicinske tilstande (hypertension, diabetes og nuværende medicin), rygestatus og tandkarakteristika (daglig børstehyppighed og tidligere tandlægebesøg).

Klinisk undersøgelse Ved baseline (T0) udførte tre trænede og kalibrerede undersøgere de kliniske undersøgelser ved hjælp af et mundspejl og en manuel parodontalsonde (CP11 Hu Friedy, Europa), med patienten i halvliggende stilling på tandlægestolen (A-dec. , Newberg, OR, USA). De kliniske undersøgelser vurderede Silness & Löe plaque-indekset (PI), Löe & Silness gingivalindekset (GI), det kliniske tilknytningstab (CAL), sonderingsdybden (PD) og blødningen ved sondering (BOP) (inter/intra) eksaminatorpålidelighed >80 %). Disse målinger blev udført på seks overflader (midlingual/palatal, disstolingual/palatal, mesiolingual/palatal, distobukcal, midbuccal og mesiobukcal) af alle tænder. Antallet af manglende tænder blev registreret.

Prøveindsamlingsprocedure Plak- og spytprøver blev indsamlet fra forsøgspersonerne ved T0, T1 og T2. Plakprøver blev taget fra tandkødsspalten ved den dybeste lommeaflæsning og fjernet fra det kliniske sted ved anvendelse af en steril universal curette. Prøveudtagningsområdet blev isoleret ved hjælp af spytudkastere og forsigtigt lufttørret. Spidsen af ​​curetten blev indsat i dybden af ​​spalte/lomme, bevæget koronalt, mens den var i kontakt med tandoverfladen, for at fjerne både sub- og supragingival plak. Prøverne blev derefter nedsænket i 0,5 ml sterilt destilleret vand i Eppendorf-rør (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamborg, Tyskland). Til indsamling af stimulerede spytprøver blev forsøgspersonerne bedt om at tygge på paraffinvoks og ekspektoreret i en plastiktragt forbundet til en graderet målecylinder. Ca. 3 ml spyt blev opsamlet fra hvert individ. Umiddelbart efter indsamling blev prøverørene anbragt i en beholder fyldt med knust is og transporteret til Oral Microbiology lab for konservering ved -800C.

Bakteriekultur H. pylori JA1-stamme blev opnået fra det medicinske fakultet, KUWAIT University. Bakteriestammen blev dyrket på trypticase sojaagar suppleret med defibrineret fåreblod (5%) ved 37 grader Celsius under mikroaerofile betingelser.

DNA-oprensning Spyt- og plakprøver blev bragt til laboratoriet på is. Efter vortexing i 1 minut ved 12000 x g blev supernatanten fjernet, og pellets blev opbevaret ved -80°C. DNA fra pellets blev oprenset ved anvendelse af et DNeasy DNA-oprensningskit (Qiagen, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev pellets behandlet med lysisbuffer og proteinase-K ved 56 grader Celsius i 1 time. DNA fra lyserede prøver blev påført en spin-søjle og vasket. Oprenset DNA blev elueret under anvendelse af nukleasefrit vand, og DNA-koncentrationerne blev målt ved UV-spektrofotometrimetoden under anvendelse af NanoDropTM 1000. Genomisk DNA fra H. pylori JA1 blev oprenset ved anvendelse af den samme metode.

Kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion (qPCR) Efter oprensning af DNA'et fra prøverne blev mængderne af H. pylori målt ved hjælp af SYBR Green kvantitativ realtids-PCR-metode under anvendelse af H. pylori-artsspecifikke primere for ureA-genet: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' og ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTACGAGTTT-3' 44. qPCR-reaktionsblandingen (25 µl) indeholdt 12,5 µl SYBR Green mastermix (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 1,0 µl hver af frem- og omvendt primer (0,4 µM), 5,0 µl DNA-skabelon og 5,5 µl H2O. Den termiske profil var som følger: en indledende denaturering ved 95 °C i 10 minutter, 40 cyklusser af 95 °C i 15-30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder. Fluorescenssignalopsamling blev indstillet til forlængelsestrinnet i hver cyklus. Alle qPCR-reaktioner blev kørt på ABapplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR-maskine. Sequence Detection Systems (SDS) (softwareversion 2.3) blev brugt til dataanalyse. Seriefortyndet genomisk DNA fra H. pylori JA1 blev brugt til at plotte Ct-værdierne mod udledt bakteriecellekoncentration (celler/ml) for hver art og til at konstruere standardkurver under anvendelse af ovenstående software. Alle målingerne blev taget i tre eksemplarer for prøver, standarder og kontroller.

Datahåndtering og statistisk analyse En reduktion i H. pylori-tallet ved brug af enten TB+M eller TB under forskellige fastebetingelser var det primære resultat af interesse i denne undersøgelse. Da der ikke var tilgængelig a priori information om effekten af ​​miswak på H. pylori, blev prøvestørrelsen beregnet til at påvise en 50 % forskel mellem grupperne, idet det antages en gennemsnitlig 30 % reduktion i H. pylori-tal mellem grupperne med en standardafvigelse på 15 %. For at opnå en power på 80 % og for en risiko alfa på 0,05 krævedes der 17 patienter pr. gruppe, som blev rundet af til 20, for at tage højde for eventuelle potentielle frafald. Forskellen i de mikrobielle tællinger blev beregnet mellem T0, T1 og T2. Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis test (kontinuerlig afhængig variabel) og chi-square test (kategorisk afhængig variabel) blev brugt til at vurdere forskellene i de generelle karakteristika mellem de to grupper. Fordeling af H. pylori mellem grupperne blev undersøgt for normalitet ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov- og Shapiro-Wilk-testene. Dataene var ikke normalfordelt, så ændringen i H. pylori-tallene blev evalueret med Wilcoxon signed rank test, og sammenligningerne mellem grupperne blev foretaget ved hjælp af Mann-Whitney U-testen. Spearmans test blev brugt til at vurdere sammenhængen mellem H. pylori-tallene (1x103 celler/ml) i plaque/spytprøver og de kliniske parodontale parametre ved baseline. Signifikansniveauet blev sat til p<0,05. Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).