Влияние жевательных палочек Miswak на пероральную инфекцию Helicobacter Pylori (Miswak)

Этические аспекты Экспериментальный протокол был одобрен этическим комитетом Центра медицинских наук (HSC) Кувейтского университета (VDR/ED/3331) и зарегистрирован на ClinicalTrials.gov как NCT02418520 (16.04.2015). Исследования проводились в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации о медицинских экспериментах на людях. Письменное информированное согласие было получено от всех участников и представлено в соответствии с рекомендациями сводных стандартов отчетности об испытаниях (CONSORT).

Дизайн исследования Это было экспериментальное исследование с рандомизированным, перекрестным, простым слепым дизайном.

Образец исследования и сбор данных Это исследование проводилось среди обычных пациентов, посещающих Стоматологический центр Кувейтского университета, Кувейт. Набор пациентов начался в феврале и был завершен к концу августа 2019 года. Вопрос PICO (P = популяция пациентов; I = представляющее интерес вмешательство; C = сравнительное вмешательство; O = результат) для этого исследования звучал так: с зубной щеткой (I) по сравнению с использованием только зубной щетки (C) при подсчете H. pylori в ротовой полости (O)?». Пациенты-добровольцы были проинформированы о компонентах исследования, и от них было получено информированное согласие. Образцы слюны и зубного налета были собраны для ПЦР-скрининга на наличие H. pylori. Критериями включения были: 1) субъекты с определяемыми уровнями H. pylori в образцах зубного налета или слюны; 2) отсутствие признаков пародонтита; и 3) не менее чем с 24 зубьями. Субъекты, получавшие антибиотикотерапию или ингибиторы протонной помпы в течение последних трех месяцев, были исключены из исследования.

Набор участников исследования и группировка В это исследование были включены 20 субъектов, которые находились на 12-часовом голодании (группа голодания) и 20 субъектов, которые не голодали (группа не голодающих). Субъекты группы, не соблюдающие пост, были набраны в период с февраля по апрель, а субъекты группы поста были набраны в период с мая по июнь 2018 года (священный месяц Рамадан). На исходном уровне (T0) каждому субъекту были присвоены номера в соответствии с хронологическим порядком включения в исследование. Как голодающие, так и не голодающие субъекты были случайным образом разделены на Группу-1 и Группу-2 (n=10 в каждой). Рандомизированное распределение испытуемых осуществлялось путем случайного бинарного исхода игральной кости, четных или нечетных чисел. Эксперты не знали о распределении участников. Субъекты группы 1 были проинструктированы использовать и зубную щетку, и мисвак (ТБ+М) в течение двух недель (Т1) и только зубную щетку (ТБ) в течение следующих двух недель (Т2); и субъектов группы 2 попросили использовать только ТБ во время T1 и TB+M во время T2 как для групп натощак, так и для групп без голодания. Один исследователь (JKB) дал участникам инструкции о том, как использовать мисвак (техника скраба пятью пальцами, в течение 15 минут, два раза в день21) и ТБ (модифицированная техника Басса, в течение двух минут, два раза в день). Образцы зубного налета и слюны были собраны в Т0, Т1 и Т2.

Анкета. Субъекты были опрошены, и была собрана информация об их социально-демографических характеристиках (возраст, пол, образование, занятость и доход), наличии отдельных заболеваний (гипертония, диабет и принимаемые лекарства), статусе курения и характеристиках зубов (ежедневная частота чистки зубов). и предыдущее посещение стоматолога).

Клиническое обследование На исходном уровне (T0) три обученных и аттестованных врача проводили клинические обследования с использованием ротового зеркала и ручного пародонтального зонда (CP11 Hu Friedy, Европа), при этом пациент находился в полулежачем положении на стоматологическом кресле (A-dec). , Ньюберг, штат Орегон, США). При клиническом обследовании оценивали индекс зубного налета Силнесса и Лё (PI), индекс десны Löe & Silness (GI), потерю клинического прикрепления (CAL), глубину зондирования (PD) и кровоточивость при зондировании (BOP) (внутри/внутри). надежность экзаменатора> 80%). Эти измерения были выполнены на шести поверхностях (среднеязычной/небной, дистально-язычной/небной, мезиолингвальной/небной, дистально-щечной, среднещечной и мезиощечной) всех зубов. Регистрировали количество отсутствующих зубов.

Процедура сбора образцов Образцы зубного налета и слюны были взяты у субъектов в Т0, Т1 и Т2. Образцы зубного налета брали из десневой щели в самом глубоком кармане и удаляли из клинической зоны с помощью стерильной универсальной кюретки. Зона отбора изолировалась с помощью слюноотсоса и осторожно высушивалась воздухом. Наконечник кюретки вводили в глубину щели/кармана, двигали коронально, при этом контактируя с поверхностью зуба, для удаления как поддесневого, так и наддесневого зубного налета. Затем образцы погружали в 0,5 мл стерильной дистиллированной воды в пробирках Эппендорфа (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Гамбург, Германия). Для сбора стимулированных образцов слюны испытуемых просили жевать парафин и отхаркивать их в пластиковую воронку, соединенную с градуированным мерным цилиндром. У каждого испытуемого было собрано около 3 мл слюны. Сразу после сбора пробирки с образцами помещали в контейнер, наполненный дробленым льдом, и транспортировали в лабораторию микробиологии полости рта для консервирования при -80°С.

Бактериальная культура штамма H. pylori JA1 была получена с медицинского факультета КУВЕЙТСКОГО университета. Бактериальный штамм выращивали на триптиказо-соевом агаре с добавлением дефибринированной овечьей крови (5%) при 37°С в микроаэрофильных условиях.

Очистка ДНК Образцы слюны и зубного налета доставляли в лабораторию на льду. После встряхивания в течение 1 минуты при 12000 g супернатант удаляли, а осадки хранили при -80°C. ДНК из осадка очищали с использованием набора для очистки ДНК DNeasy (Qiagen, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, осадки обрабатывали лизисным буфером и протеиназой-К при 56°С в течение 1 часа. ДНК из лизированных образцов наносили на спин-колонку и промывали. Очищенную ДНК элюировали водой, не содержащей нуклеаз, и концентрации ДНК измеряли методом УФ-спектрофотометрии с использованием NanoDropTM 1000. Геномную ДНК H.pylori JA1 очищали тем же методом.

Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР) После очистки ДНК из образцов количество H. pylori измеряли методом количественной ПЦР в реальном времени SYBR Green с использованием видоспецифичных праймеров H. pylori для гена ureA: ureA-F. : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' и ureA-R: 5'-GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. Реакционная смесь для количественной ПЦР (25 мкл) содержала 12,5 мкл мастер-микса SYBR Green (набор Power SYBR Green®, Applied Biosystems), по 1,0 мкл прямого и обратного праймеров (0,4 мкМ), 5,0 мкл матрицы ДНК и 5,5 мкл H2O. Термический профиль был следующим: начальная денатурация при 95°С в течение 10 мин, 40 циклов 95°С в течение 15-30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. Получение флуоресцентного сигнала устанавливали на этапе элонгации каждого цикла. Все реакции количественной ПЦР проводили на машине ABpplied Biosystems® Fast 7500 для ПЦР в реальном времени. Для анализа данных использовали системы обнаружения последовательностей (SDS) (версия программного обеспечения 2.3). Серийно разбавленную геномную ДНК из H. pylori JA1 использовали в реакциях для построения графика значений Ct в зависимости от выведенной концентрации бактериальных клеток (клеток/мл) для каждого вида и для построения стандартных кривых с использованием вышеуказанного программного обеспечения. Все измерения проводились в трех экземплярах для образцов, стандартов и контролей.

Управление данными и статистический анализ Уменьшение количества H. pylori при использовании либо ТБ+М, либо ТБ при различных условиях натощак было основным результатом, представляющим интерес в этом исследовании. Поскольку априорная информация о влиянии мисвака на H. pylori отсутствовала, размер выборки был рассчитан для выявления 50% разницы между группами, предполагая среднее снижение количества H. pylori на 30% между группами со стандартным отклонением. 15%. Для получения мощности 80% и для риска альфа 0,05 требовалось 17 пациентов в группе, что было округлено до 20, чтобы учесть любые потенциальные выбывания. Разницу в количестве микробов рассчитывали между Т0, Т1 и Т2. U-критерий Манна-Уитни или критерий Крускала-Уоллиса (непрерывная зависимая переменная) и критерий хи-квадрат (категориальная зависимая переменная) использовались для оценки различий в общих характеристиках между двумя группами. Распределение H. pylori между группами исследовали на предмет нормальности с помощью тестов Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Данные не были нормально распределены, поэтому внутригрупповое изменение количества H. pylori оценивали с помощью знакового рангового критерия Уилкоксона, а межгрупповые сравнения проводились с использованием U-критерия Манна-Уитни. Тест Спирмена использовали для оценки корреляции между количеством H. pylori (1x103 клеток/мл) в образцах зубного налета/слюны и клиническими параметрами пародонта на исходном уровне. Уровень значимости был установлен на уровне p<0,05. Все статистические анализы проводились с использованием SPSS 26.0 (IBM Corp., Армонк, штат Нью-Йорк, США).