Effekten av Miswak-tyggepinner på den orale Helicobacter Pylori-infeksjonen (Miswak)

Etiske aspekter Den eksperimentelle protokollen ble godkjent av Health Science Center (HSC) etiske komité ved Kuwait University (VDR/ED/3331) og er registrert på ClinicalTrials.gov som NCT02418520 (16.04.2015). Forskning ble utført i henhold til prinsippene skissert i Helsinki-erklæringen om human medisinsk eksperimentering. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne og presenteres i samsvar med retningslinjene for konsoliderte standarder for rapporteringsforsøk (CONSORT).

Studiedesign Dette var en eksperimentell studie med et randomisert, cross-over, enkeltblinddesign.

Studieutvalg og datainnsamling Denne studien ble utført blant vanlige pasienter som går på tannlegesenteret ved Kuwait University, Kuwait. Pasientrekruttering startet i februar og ble fullført innen utgangen av august 2019. PICO-spørsmålet (P = Pasientpopulasjon; I = Intervensjon av interesse; C = Komparativ intervensjon; O = Utfall)-spørsmålet for denne studien var, "for forsøkspersoner under forskjellige fasteforhold (P), hva er effekten av å bruke miswak-tyggepinner sammen med tannbørste (I) versus bruk av kun tannbørste (C) på orale H. pylori-tellinger (O)?". Frivillige pasienter ble informert om studiekomponentene og informert samtykke ble innhentet fra dem. Spytt- og plakkprøver ble samlet for PCR-screening for å påvise tilstedeværelsen av H. pylori. Inklusjonskriteriene var: 1) personer med påvisbare nivåer av H. pylori i enten plakk- eller spyttprøver; 2) ingen tegn på periodontitt; og, 3) med minst 24 tenner. Forsøkspersoner som fikk antibiotikabehandling eller protonpumpehemmere i løpet av de siste tre månedene ble ekskludert fra studien.

Rekruttering av studiedeltakere og gruppering Denne studien inkluderte 20 forsøkspersoner som var på 12-timers faste (fastegruppe) og 20 forsøkspersoner som ikke fastet (ikke-fastende gruppe). Ikke-fastende gruppefag ble rekruttert mellom februar og april, og fastende gruppefag ble rekruttert mellom mai og juni 2018 (den hellige måneden Ramadan). Ved baseline (T0) ble hvert forsøksperson tildelt nummer basert på den kronologiske rekkefølgen for påmelding i studien. Både fastende og ikke-fastende personer ble tilfeldig delt inn i gruppe-1 og gruppe-2 (n=10 hver). Randomisert tildeling av fagene ble utført ved et tilfeldig binært utfall av en terning, partall eller oddetall. Sensorene ble holdt uvitende om deltakertildelingen. Gruppe-1-personer ble instruert til å bruke både tannbørste og miswak (TB+M) i to uker (T1) og kun tannbørste (TB) i de neste to ukene (T2); og gruppe-2-personer ble bedt om å bruke bare TB under T1 og TB+M under T2, både for de fastende og ikke-fastende gruppene. Deltakerne fikk instruksjoner om hvordan de skulle bruke miswak (fem fingergrep, skrubbeteknikk, i 15 minutter, to ganger daglig21) og TB (modifisert bassteknikk, i to minutter, to ganger daglig) av en enkelt etterforsker (JKB). Plakk- og spyttprøver ble samlet ved T0, T1 og T2.

Spørreskjema Forsøkspersonene ble intervjuet og det ble samlet inn informasjon om deres sosiodemografiske egenskaper (alder, kjønn, utdanning, sysselsetting og inntekt), tilstedeværelse av utvalgte medisinske tilstander (hypertensjon, diabetes og aktuelle medisiner), røykestatus og tannegenskaper (daglig pussefrekvens og tidligere tannlegebesøk).

Klinisk undersøkelse Ved baseline (T0) utførte tre trente og kalibrerte undersøkere de kliniske undersøkelsene ved hjelp av et munnspeil og en manuell periodontal probe (CP11 Hu Friedy, Europa), med pasienten i halvliggende stilling på tannlegestolen (A-des. , Newberg, OR, USA). De kliniske undersøkelsene vurderte Silness & Löe plakkindeks (PI), Löe & Silness gingivalindeks (GI), klinisk festetap (CAL), sonderingsdybde (PD) og blødning ved sondering (BOP) (inter/intra) sensorreliabilitet >80 %). Disse målingene ble utført på seks overflater (midlingual/palatal, distolingual/palatal, mesiolingual/palatal, distobukcal, midbuccal og mesiobukcal) av alle tenner. Antall manglende tenner ble registrert.

Prosedyre for prøvetaking Plakk- og spyttprøver ble tatt fra forsøkspersonene ved T0, T1 og T2. Plakkprøver ble tatt fra tannkjøttspalten ved dypeste lommeavlesning og fjernet fra det kliniske stedet ved bruk av en steril universalkyrett. Prøveområdet ble isolert ved bruk av spyttutkastere og tørket forsiktig med luft. Spissen av kyretten ble satt inn i dybden av sprekken/lommen, beveget koronalt mens den var i kontakt med tannoverflaten, for å fjerne både sub- og supragingival plakk. Prøvene ble deretter nedsenket i 0,5 ml sterilt destillert vann i Eppendorf-rør (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Tyskland). For innsamling av stimulerte spyttprøver ble forsøkspersonene bedt om å tygge på parafinvoks og ekspektorert inn i en plasttrakt koblet til en gradert målesylinder. Omtrent 3 ml spytt ble samlet fra hvert individ. Umiddelbart etter innsamling ble prøverørene plassert i en beholder fylt med knust is og transportert til Oral Microbiology lab for konservering ved -800C.

Bakteriekultur H. pylori JA1-stamme ble hentet fra Det medisinske fakultet, KUWAIT University. Bakteriestammen ble dyrket på trypticase soyaagar supplert med defibrinert saueblod (5 %) ved 37 grader Celsius under mikroaerofile forhold.

DNA-rensing Spytt- og plakkprøver ble brakt til laboratoriet på is. Etter vortexing i 1 minutt ved 12000 x g, ble supernatanten fjernet, og pelletene ble lagret ved -80°C. DNA fra pelletene ble renset ved å bruke et DNeasy DNA-rensesett (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble pellets behandlet med lyseringsbuffer og proteinase-K ved 56 grader Celsius i 1 time. DNA fra lyserte prøver ble påført en spinnkolonne og vasket. Renset DNA ble eluert ved bruk av nukleasefritt vann og DNA-konsentrasjonene ble målt ved UV-spektrofotometrimetoden ved bruk av NanoDropTM 1000. Genomisk DNA fra H. pylori JA1 ble renset ved å bruke samme metode.

Kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (qPCR) Etter rensing av DNA fra prøvene, ble mengdene av H. pylori målt ved hjelp av SYBR Green kvantitativ sanntids PCR-metode ved bruk av H. pylori artsspesifikke primere for ureA-genet: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' og ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTACGAGTTT-3' 44. qPCR-reaksjonsblandingen (25 µl) inneholdt 12,5 µl SYBR Green mastermix (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 1,0 µl hver av forover- og reversprimer (0,4 µM), 5,0 µl DNA-mal og 5,5 µl H2O. Den termiske profilen var som følger: en innledende denaturering ved 95 °C i 10 minutter, 40 sykluser på 95 °C i 15-30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder. Fluorescerende signalinnsamling ble satt til forlengelsestrinnet i hver syklus. Alle qPCR-reaksjoner ble kjørt på ABapplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR-maskin. Sequence Detection Systems (SDS) (programvareversjon 2.3) ble brukt til dataanalyse. Serielt fortynnet genomisk DNA fra H. pylori JA1 ble brukt for å plotte Ct-verdiene mot utledet bakteriecellekonsentrasjon (celler/ml) for hver art og for å konstruere standardkurver ved bruk av programvaren ovenfor. Alle målingene ble tatt i tre eksemplarer for prøver, standarder og kontroller.

Databehandling og statistisk analyse En reduksjon i H. pylori-tellingen ved bruk av enten TB+M eller TB under forskjellige fasteforhold var det primære resultatet av interesse i denne studien. Siden ingen a priori informasjon om effekten av miswak på H. pylori var tilgjengelig, ble prøvestørrelsen beregnet for å oppdage en 50 % forskjell mellom gruppene, forutsatt en gjennomsnittlig 30 % reduksjon i H. pylori-tall mellom gruppene, med et standardavvik på 15 %. For å oppnå en styrke på 80 % og for en risikoalfa på 0,05, var det nødvendig med 17 pasienter per gruppe, som ble rundet av til 20, for å ta hensyn til eventuelle frafall. Forskjellen i antall mikrobielle ble beregnet mellom T0, T1 og T2. Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis test (kontinuerlig avhengig variabel) og kjikvadrat test (kategorisk avhengig variabel) ble brukt for å vurdere forskjellene i de generelle egenskapene mellom de to gruppene. Fordeling av H. pylori mellom gruppene ble undersøkt for normalitet ved å bruke Kolmogorov-Smirnov- og Shapiro-Wilk-testene. Dataene var ikke normalfordelt, så intragruppeendringen i H. pylori-tall ble evaluert med Wilcoxon signed rank test og intergruppesammenlikningene ble gjort ved å bruke Mann-Whitney U-test. Spearmans test ble brukt for å vurdere korrelasjonen mellom H. pylori-tellingene (1x103celler/ml) i plakk/spyttprøver og de kliniske periodontale parameterne ved baseline. Signifikansnivået ble satt til p<0,05. Alle statistiske analyser ble utført ved bruk av SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).