Miswak-purupuikkojen vaikutus suun Helicobacter Pylori -infektioon (Miswak)

Eettiset näkökohdat Kokeellinen protokolla on hyväksytty Kuwaitin yliopiston Health Science Centerin (HSC) eettisessä komiteassa (VDR/ED/3331), ja se on rekisteröity osoitteessa ClinicalTrials.gov nimellä NCT02418520 (16.4.2015). Tutkimus tehtiin Helsingin ihmislääketieteellisen kokeen julistuksen periaatteiden mukaisesti. Kirjallinen tietoinen suostumus hankittiin kaikilta osallistujilta, ja se esitetään konsolidoitujen raportointistandardien (CONSORT) ohjeiden mukaisesti.

Tutkimussuunnittelu Tämä oli kokeellinen tutkimus, jossa oli satunnaistettu, ristikkäinen, yksisokkomuotoinen suunnittelu.

Tutkimusnäyte ja tiedonkeruu Tämä tutkimus tehtiin Kuwaitin yliopiston Kuwaitin hammaslääkärikeskuksessa säännöllisesti käyvien potilaiden keskuudessa. Potilaiden rekrytointi alkoi helmikuussa ja saatiin päätökseen elokuun 2019 loppuun mennessä. Tämän tutkimuksen PICO-kysymys (P = Potilaspopulaatio; I = Kiinnostava interventio; C = Vertaileva interventio; O = Tulos) oli, "mikä on eri paasto-olosuhteissa (P) oleville koehenkilöille, mikä on vaikutus miswak-purutikuilla. hammasharjalla (I) verrattuna pelkän hammasharjan (C) käyttämiseen oraalisissa H. pylori -määrissä (O)?". Vapaaehtoispotilaille kerrottiin tutkimuksen osista ja heiltä saatiin tietoinen suostumus. Sylki- ja plakkinäytteet kerättiin PCR-seulontaa varten H. pylorin läsnäolon havaitsemiseksi. Sisällyttämiskriteerit olivat: 1) kohteet, joilla oli havaittavissa olevia H. pylori-tasoja joko plakki- tai sylkinäytteissä; 2) ei näyttöä parodontiittista; ja 3) vähintään 24 hammasta. Koehenkilöt, jotka ovat saaneet antibioottihoitoa tai protonipumpun estäjiä viimeisen kolmen kuukauden aikana, suljettiin pois tutkimuksesta.

Tutkimukseen osallistuneiden rekrytointi ja ryhmittely Tässä tutkimuksessa oli 20 henkilöä, jotka olivat 12 tunnin paastossa (paastoryhmä) ja 20 henkilöä, jotka eivät olleet paastonneet (ei-paastoava ryhmä). Ei-paastoavat ryhmäkoehenkilöt rekrytoitiin helmi-huhtikuussa ja paastoryhmäkohteet touko-kesäkuussa 2018 (ramadanin pyhä kuukausi). Lähtötilanteessa (T0) jokaiselle koehenkilölle annettiin numerot tutkimukseen ilmoittautumisen kronologisen järjestyksen perusteella. Sekä paastonneet että ei-paastoneet jaettiin satunnaisesti ryhmään 1 ja ryhmään 2 (n = 10 kumpikin). Koehenkilöiden satunnaismääritys suoritettiin satunnaisella binäärituloksella nopan, parilliset tai parittomat luvut. Tutkijat eivät olleet tietoisia osallistujien jakautumisesta. Ryhmän 1 koehenkilöitä neuvottiin käyttämään sekä hammasharjaa että miswakia (TB+M) kahden viikon ajan (T1) ja vain hammasharjaa (TB) seuraavien kahden viikon ajan (T2); ja ryhmän 2 koehenkilöitä pyydettiin käyttämään vain tuberkuloosia T1:n aikana ja TB+M:tä T2:n aikana sekä paasto- että ei-paastoryhmissä. Yksi tutkija (JKB) antoi osallistujille ohjeet miswakin (viiden sormen otteen, kuorintatekniikka, 15 minuuttia, kahdesti päivässä21) ja TB:n (muunneltu bassotekniikka, kaksi minuuttia, kahdesti päivässä) käyttöön. Plakki- ja sylkinäytteet kerättiin kohdissa T0, T1 ja T2.

Kyselylomake Koehenkilöitä haastateltiin ja kerättiin tietoja heidän sosio-demografisista ominaisuuksistaan ​​(ikä, sukupuoli, koulutus, työllisyys ja tulot), valittujen sairauksien esiintymisestä (hypertensio, diabetes ja nykyiset lääkkeet), tupakoinnin tilasta ja hampaiden ominaisuuksista (päivittäinen harjaustiheys) ja edellinen hammaslääkärikäynti).

Kliininen tutkimus Lähtötilanteessa (T0) kolme koulutettua ja kalibroitua tutkijaa suoritti kliiniset tutkimukset käyttämällä suupeiliä ja manuaalista parodontaalista koetinta (CP11 Hu Friedy, Eurooppa) potilaan ollessa puoliksi makuuasennossa hammaslääkärin tuolilla (A-dec. , Newberg, OR, USA). Kliinisissä tutkimuksissa arvioitiin Silness & Löe plakkiindeksi (PI), Löe & Silness gingival index (GI), kliinisen kiinnittymisen menetys (CAL), mittaussyvyys (PD) ja verenvuoto koetuksella (BOP) (inter/intra). tutkijan luotettavuus >80 %). Nämä mittaukset suoritettiin kaikkien hampaiden kuudelle pinnalle (keskikieli/palataalinen, distolinguaalinen/palataalinen, mesiolinguaalinen/palataalinen, distobukkaalinen, midbuccal ja mesiobuccal). Puuttuvien hampaiden määrä kirjattiin.

Näytteenottomenettely Plakki- ja sylkinäytteet kerättiin koehenkilöiltä ajankohtina T0, T1 ja T2. Plakkinäytteet otettiin ienraosta syvimmällä taskulukemalla ja poistettiin kliinisestä paikasta käyttämällä steriiliä yleiskyrettiä. Näytteenottoalue eristettiin käyttämällä syljenpoistolaitteita ja kuivattiin varovasti ilmalla. Kyretin kärki työnnettiin rakon/taskun syvyyteen, liikutettiin koronaaalisesti ollessaan kosketuksissa hampaan pintaan sekä sub- että supragingivaalisen plakin poistamiseksi. Sitten näytteet upotettiin 0,5 ml:aan steriiliä tislattua vettä Eppendorf-putkissa (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hampuri, Saksa). Stimuloitujen sylkinäytteiden keräämistä varten koehenkilöitä pyydettiin pureskelemaan parafiinivahaa ja yskättiin muovisuppiloon, joka oli yhdistetty lajiteltuun mittasylinteriin. Jokaiselta koehenkilöltä kerättiin noin 3 ml sylkeä. Välittömästi keräämisen jälkeen näyteputket asetettiin jäämurskalla täytettyyn säiliöön ja kuljetettiin Oral Microbiology -laboratorioon -800 C:ssa säilytettäväksi.

Bakteeriviljelmä H. pylori JA1 -kanta saatiin KUWAITin yliopiston lääketieteellisestä tiedekunnasta. Bakteerikantaa kasvatettiin tryptikaasi-soijaagarilla, jota oli täydennetty defibrinoidulla lampaanverellä (5 %), 37 celsiusasteessa mikroaerofiilisissä olosuhteissa.

DNA:n puhdistus Sylki- ja plakkinäytteet tuotiin laboratorioon jäillä. 1 minuutin vorteksoimisen jälkeen 12 000 x g:ssa supernatantti poistettiin ja pellettejä säilytettiin -80 °C:ssa. Pelleteistä saatu DNA puhdistettiin käyttämällä DNeasy DNA -puhdistussarjaa (Qiagen, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna pellettejä käsiteltiin lyysipuskurilla ja proteinaasi-K:lla 56 celsiusasteessa 1 tunnin ajan. Lyysoiduista näytteistä saatu DNA asetettiin spin-pylvääseen ja pestiin. Puhdistettu DNA eluoitiin käyttämällä nukleaasivapaata vettä ja DNA-pitoisuudet mitattiin UV-spektrofotometrialla käyttäen NanoDropTM 1000 -laitetta. Genominen DNA H. pylori JA1:stä puhdistettiin käyttämällä samaa menetelmää.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qPCR) DNA:n puhdistamisen jälkeen näytteistä H. pylorin määrät mitattiin SYBR Greenin kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR-menetelmällä käyttäen H. pylori -lajikohtaisia ​​alukkeita ureA-geenille: ureA-F. : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' ja ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. QPCR-reaktioseos (25 µl) sisälsi 12,5 µl SYBR Green -masteriseosta (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 1,0 µl eteenpäin ja käänteistä aluketta (0,4 µM), 5,0 µl DNA-templaattia ja 5,5 µl H2O:ta. Lämpöprofiili oli seuraava: alkuperäinen denaturaatio 95 °C:ssa 10 minuuttia, 40 sykliä 95 °C:ssa 15-30 sekuntia, 55 °C:ssa 30 sekuntia ja 72 °C:ssa 30 sekuntia. Fluoresoivan signaalin hankinta asetettiin kunkin syklin venymisvaiheeseen. Kaikki qPCR-reaktiot ajettiin ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR-koneella. Tietojen analysointiin käytettiin SDS (Sequence Detection Systems) -järjestelmää (ohjelmistoversio 2.3). Sarjalaimennettua genomista DNA:ta H. pylori JA1:stä käytettiin reaktioissa Ct-arvojen piirtämiseen päätellyn bakteerisolukonsentraation (soluja/ml) funktiona kullekin lajille ja standardikäyrien muodostamiseen käyttämällä yllä olevaa ohjelmistoa. Kaikki mittaukset tehtiin kolmena kappaleena näytteille, standardeille ja kontrolleille.

Tiedonhallinta ja tilastollinen analyysi H. pylori -määrän vähentäminen käyttämällä joko TB+M:tä tai tuberkuloosia erilaisissa paasto-olosuhteissa oli ensisijainen kiinnostava tulos tässä tutkimuksessa. Koska a priori tietoa miswakin vaikutuksesta H. pyloriin ei ollut saatavilla, otoskoko laskettiin havaitsemaan 50 % ero ryhmien välillä olettaen, että H. pylori -määrät vähenivät keskimäärin 30 % ryhmien välillä keskihajonnan kanssa. 15 %:sta. 80 %:n tehon ja riskin alfan 0,05 saavuttamiseksi vaadittiin 17 potilasta ryhmää kohden, mikä pyöristettiin 20:een mahdollisten keskeytysten huomioon ottamiseksi. Mikrobimäärien erot laskettiin T0:n, T1:n ja T2:n välillä. Mann-Whitneyn U-testiä tai Kruskal-Wallis-testiä (jatkuva riippuva muuttuja) ja chi-neliötestiä (kategorinen riippuvainen muuttuja) käytettiin arvioimaan näiden kahden ryhmän yleisten ominaisuuksien eroja. H. pylorin jakautumista ryhmien välillä tutkittiin normaalin suhteen Kolmogorov-Smirnov- ja Shapiro-Wilk-testeillä. Tiedot eivät jakautuneet normaalisti, joten H. pylori -lukemien ryhmän sisäinen muutos arvioitiin Wilcoxonin signed rank -testillä ja ryhmien väliset vertailut tehtiin Mann-Whitneyn U-testillä. Spearmanin testiä käytettiin korrelaation arvioimiseen plakki/sylkinäytteissä olevien H. pylori -määrien (1 x 103 solua/ml) ja kliinisen periodontaalisten parametrien välillä lähtötasolla. Merkitystasoksi asetettiin p<0,05. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä SPSS 26.0:aa (IBM Corp., Armonk, NY, USA).