A Miswak rágórudak hatása az orális Helicobacter Pylori fertőzésre (Miswak)

Etikai szempontok A kísérleti protokollt a Kuvaiti Egyetem Egészségtudományi Központja (HSC) etikai bizottsága hagyta jóvá (VDR/ED/3331), és a ClinicalTrials.gov webhelyen NCT02418520 néven van bejegyezve (2015.04.16.). A kutatás a Helsinki humán orvosi kísérletekről szóló nyilatkozatában megfogalmazott elvek szerint zajlott. Valamennyi résztvevőtől írásos beleegyezést kaptunk, amelyet a kísérletek jelentésére vonatkozó összevont szabványok (CONSORT) iránymutatásai szerint kell bemutatni.

Tanulmánytervezés Ez egy kísérleti vizsgálat volt, randomizált, keresztezett, egyszeres vak tervezéssel.

Vizsgálati minta és adatgyűjtés Ezt a vizsgálatot a Kuvaiti Egyetem Fogászati ​​Központjában rendszeresen látogató betegek körében végezték. A betegtoborzás februárban kezdődött és 2019 augusztusának végére fejeződött be. A PICO (P = Betegpopuláció; I = Intervention of Intervention; C = Összehasonlító beavatkozás; O = Eredmény) kérdése ebben a vizsgálatban az volt, hogy „a különböző éhgyomri körülmények között (P) lévő alanyok esetében milyen hatással van a miswak rágórudak használata. fogkefével (I) szemben a csak fogkefe (C) használatával az orális H. pylori számok (O)?". Az önkéntes betegek tájékoztatást kaptak a vizsgálati összetevőkről, és tájékozott beleegyezést kaptak tőlük. A H. pylori jelenlétének kimutatására nyál- és plakkmintákat vettünk PCR-szűréshez. A felvételi kritériumok a következők voltak: 1) a plakk- vagy nyálmintákban kimutatható H. pylori szinttel rendelkező alanyok; 2) nincs fogágygyulladásra utaló jel; és 3) legalább 24 foggal. Azokat az alanyokat, akik az elmúlt három hónapban antibiotikum-terápiát vagy protonpumpa-gátlót kaptak, kizárták a vizsgálatból.

A vizsgálatban résztvevők toborzása és csoportosítás Ebben a vizsgálatban 20 olyan alany vett részt, akik 12 órás éheztetésen voltak (böjt csoport), és 20 olyan alany, akik nem koplaltak (nem koplalt csoport). A nem böjtölő csoportos alanyokat február és április között, a böjt csoportos alanyokat pedig 2018 májusa és júniusa között (a ramadán szent hónapja) vették fel. Kiinduláskor (T0) minden alanyhoz számokat rendeltek a vizsgálatba való beiratkozás időrendi sorrendje alapján. Mind a koplalt, mind a nem koplalt alanyokat véletlenszerűen az 1. és a 2. csoportba (n=10) csoportosítottuk. Az alanyok véletlenszerű kiosztását egy kocka véletlenszerű bináris eredményével, páros vagy páratlan számokkal végeztük. A vizsgáztatók nem voltak tisztában a résztvevők elosztásával. Az 1. csoportba tartozó személyeket arra utasították, hogy fogkefét és miswak-ot (TB+M) is használjanak két hétig (T1), és csak fogkefét (TB) a következő két hétben (T2); és a 2. csoport alanyait arra kérték, hogy csak TB-t használjanak a T1 alatt és TB+M-et a T2 alatt, mind az éhező, mind a nem koplalt csoportban. A résztvevők utasításokat kaptak a miswak (ötujjas markolat, dörzsölési technika, 15 percig, naponta kétszer21) és a TB (módosított basszustechnika, két percig, naponta kétszer) használatára egyetlen vizsgáló (JKB). A plakk- és nyálmintákat T0, T1 és T2 időpontokban vettük.

Kérdőív Az alanyokkal interjút készítettek, és információkat gyűjtöttek szocio-demográfiai jellemzőikről (életkor, nem, iskolai végzettség, foglalkoztatás és jövedelem), kiválasztott egészségügyi állapotuk (hipertónia, cukorbetegség és jelenlegi gyógyszerek), dohányzási állapotuk és fogászati ​​jellemzőik (napi fogmosás gyakorisága). és korábbi fogorvosi látogatás).

Klinikai vizsgálat Kiinduláskor (T0) három képzett és kalibrált vizsgáló végezte a klinikai vizsgálatokat szájtükör és kézi periodontális szondával (CP11 Hu Friedy, Európa), a páciens félig fekvő helyzetben a fogorvosi széken (A-dec. , Newberg, OR, USA). A klinikai vizsgálatok értékelték a Silness & Löe plakk indexet (PI), a Löe & Silness gingival indexet (GI), a klinikai tapadás elvesztését (CAL), a szondázási mélységet (PD) és a vérzést a szondázáskor (BOP) (inter/intra). vizsgáztatói megbízhatóság >80%). Ezeket a méréseket az összes fog hat felületén (középnyelvi/palatális, disztolinguális/palatális, mesiolinguális/palatális, disztobukkális, midbuccalis és mesiobuccalis) végeztük. Feljegyeztük a hiányzó fogak számát.

Mintavételi eljárás A plakk- és nyálmintákat az alanyoktól T0, T1 és T2 időpontban vettük. A plakkmintákat az ínyrésből vettük a legmélyebb zsebleolvasáskor, és steril univerzális küret segítségével távolítottuk el a klinikai helyről. A mintavételi területet nyálkidobó segítségével izoláltuk, és levegővel óvatosan szárítottuk. A küretta hegyét a rés/zseb mélyébe illesztettük, a fogfelülettel érintkezve koronálisan mozgattuk, hogy eltávolítsuk mind a szub-, mind a szupragingivális plakkot. A mintákat ezután 0,5 ml steril desztillált vízbe merítettük Eppendorf-csövekben (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburg, Németország). A stimulált nyálminták gyűjtéséhez az alanyokat megkérték, hogy paraffinviaszt rágjanak meg, és egy műanyag tölcsérbe köpték ki, amelyet egy fokozatos mérőhengerhez csatlakoztattak. Minden alanytól körülbelül 3 ml nyálat gyűjtöttünk össze. Közvetlenül a begyűjtés után a mintacsöveket zúzott jéggel töltött edénybe helyezték, és az Oral Microbiology laborba szállították -800 C-on történő tartósításra.

Bakteriális tenyészet A H. pylori JA1 törzset a KUWAIT Egyetem Orvostudományi Karáról szereztük be. A baktériumtörzset defibrinált birkavérrel (5%) kiegészített triptikáz szójaagaron tenyésztettük 37 Celsius-fokon, mikroaerofil körülmények között.

DNS tisztítás A nyál- és plakkmintákat jégen vittük a laboratóriumba. 1 perces vortexelés után 12000 x g-vel a felülúszót eltávolítottuk, és a pelleteket -80 °C-on tároltuk. A pelletekből származó DNS-t DNeasy DNS-tisztító készlettel (Qiagen, Németország) tisztítottuk a gyártó utasításai szerint. Röviden, a pelleteket lízispufferrel és proteináz-K-val kezeltük 56 Celsius-fokon 1 órán át. A lizált mintákból származó DNS-t spin oszlopra vittük és mostuk. A tisztított DNS-t nukleázmentes vízzel eluáltuk, és a DNS-koncentrációkat UV-spektrofotometriás módszerrel, NanoDropTM 1000 alkalmazásával mértük. A H. pylori JA1 genomiális DNS-ét ugyanezzel a módszerrel tisztítottuk.

Kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakció (qPCR) A DNS mintákból történő tisztítása után a H. pylori mennyiségét SYBR Green kvantitatív valós idejű PCR módszerrel mértük, H. pylori fajspecifikus primerekkel az ureA génre: ureA-F. : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' és ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. A qPCR reakcióelegy (25 µl) 12,5 µl SYBR Green mesterkeveréket (Power SYBR Green® Kit, Applied Biosystems), 1,0 µl forward és reverse primert (0,4 µM), 5,0 µl DNS templátot és 5,5 µl H2O-t tartalmazott. A termikus profil a következő volt: kezdeti denaturáció 95 °C-on 10 percig, 40 ciklus 95 °C-on 15-30 másodpercig, 55 °C-on 30 másodpercig és 72 °C-on 30 másodpercig. A fluoreszcens jel gyűjtését minden ciklus megnyújtási lépésében állítottuk be. Az összes qPCR reakciót ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR gépen futtattuk. Az adatok elemzéséhez Sequence Detection Systems (SDS) (szoftververzió 2.3) szolgált. H. pylori JA1-ből sorozathígított genomiális DNS-t használtunk a reakciók során a Ct értékek ábrázolására a kikövetkeztetett bakteriális sejtkoncentráció (sejt/ml) függvényében minden egyes faj esetében, és standard görbék felépítésére a fenti szoftver segítségével. Minden mérést három párhuzamosban végeztünk a minták, a standardok és a kontrollok esetében.

Adatkezelés és statisztikai elemzés Ebben a vizsgálatban a H. pylori szám csökkenése volt TB+M vagy TB különböző éhgyomri körülmények között történő alkalmazásával. Mivel nem állt rendelkezésre előzetes információ a miswak H. pylorira gyakorolt ​​hatásáról, a minta méretét úgy számítottuk ki, hogy a csoportok között 50%-os különbséget észleljen, feltételezve, hogy a csoportok között átlagosan 30%-kal csökken a H. pylori szám, standard deviáció mellett. 15%-ról. A 80%-os hatvány és a 0,05-ös kockázati alfa eléréséhez csoportonként 17 betegre volt szükség, amelyet 20-ra kerekítettek, hogy figyelembe vegyék az esetleges lemorzsolódást. A mikrobaszám különbségét T0, T1 és T2 között számítottuk ki. Mann-Whitney U-próbát vagy Kruskal-Wallis tesztet (folyamatos függő változó) és khi-négyzet tesztet (kategorikus függő változó) használtunk a két csoport általános jellemzői közötti különbségek felmérésére. A H. pylori csoportok közötti megoszlását Kolmogorov-Smirnov és Shapiro-Wilk tesztekkel vizsgáltuk normalitás szempontjából. Az adatok nem voltak normális eloszlásúak, ezért a H. pylori számok csoporton belüli változását Wilcoxon előjeles rang teszttel értékeltük, a csoportok közötti összehasonlításokat pedig Mann-Whitney U-teszttel végeztük. Spearman-tesztet alkalmaztunk a plakk/nyálminták H. pylori-száma (1x103 sejt/ml) és a klinikai parodontális paraméterek közötti összefüggés felmérésére a kiinduláskor. A szignifikancia szintet p<0,05-re állítottuk be. Minden statisztikai elemzést SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) segítségével végeztünk.