口腔ヘリコバクター ピロリ感染に対するミスワク チューイン スティックの効果 (Miswak)

倫理的側面 実験プロトコルは、クウェート大学の健康科学センター (HSC) 倫理委員会 (VDR/ED/3331) によって承認され、ClinicalTrials.gov に NCT02418520 (16/04/2015) として登録されています。 研究は、人体医学実験に関するヘルシンキ宣言に概説されている原則に従って実施されました。 書面によるインフォームド コンセントは、すべての参加者から得られ、報告試験 (CONSORT) ガイドラインの統合基準に従って提示されます。

研究デザイン これは、無作為化、クロスオーバー、シングル ブラインド デザインによる実験的研究でした。

研究サンプルとデータ収集 この研究は、クウェートのクウェート大学のデンタル センターに通う通常の患者を対象に実施されました。 患者募集は 2 月に開始され、2019 年 8 月末までに完了しました。 この研究の PICO (P = 患者集団、I = 関心のある介入、C = 比較介入、O = 結果) の質問は、「さまざまな絶食状態 (P) にある被験者について、ミスワク チューイン スティックを一緒に使用した場合の効果は何ですか?」歯ブラシを使用した場合 (I) と歯ブラシのみを使用した場合 (C) の口腔ピロリ菌数 (O) の違いは?". ボランティアの患者は、研究の構成要素について説明を受け、患者からインフォームド コンセントを得た。 Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの存在を検出するためのＰＣＲスクリーニングのために、唾液およびプラークサンプルを収集した。 包含基準は次のとおりです。1）プラークまたは唾液サンプルのいずれかでピロリ菌が検出可能なレベルの被験者。 2) 歯周炎の証拠がない; 3) 少なくとも 24 本の歯を持つ。 過去3か月以内に抗生物質療法またはプロトンポンプ阻害剤を受けた被験者は、研究から除外されました。

研究参加者の募集とグループ化 この研究には、12 時間絶食した 20 人の被験者 (絶食グループ) と、絶食していない 20 人の被験者 (非絶食グループ) が含まれていました。 非断食グループの被験者は 2 月から 4 月の間に募集され、断食グループの被験者は 2018 年 5 月から 6 月 (ラマダンの聖なる月) の間に募集されました。 ベースライン (T0) で、各被験者には、研究への登録の時系列順に基づいて番号が割り当てられました。 断食中および非絶食中の被験者の両方を、無作為にグループ-1およびグループ-2に細分した(各n=10)。 被験者の無作為割り当ては、サイコロ、偶数または奇数のランダムなバイナリ結果によって実行されました。 試験官は、参加者の割り当てを知らされていませんでした。 グループ 1 の被験者は、2 週間 (T1) は歯ブラシとミスワク (TB+M) の両方を使用し、次の 2 週間 (T2) は歯ブラシのみ (TB) を使用するように指示されました。グループ 2 の被験者は、絶食グループと非絶食グループの両方で、T1 では TB のみを使用し、T2 では TB+M を使用するように求められました。 参加者は、1 人の研究者 (JKB) によって、miswak (5 本の指でつかむ、スクラブ テクニック、15 分間、1 日 2 回 21) および TB (修正されたバス テクニック、2 分間、1 日 2 回) の使用方法について説明を受けました。 プラークおよび唾液サンプルは、T0、T1、および T2 で収集されました。

質問票 被験者にインタビューを行い、社会人口学的特徴 (年齢、性別、教育、雇用、収入)、選択した病状 (高血圧、糖尿病、現在の投薬) の有無、喫煙状況、歯の特徴 (毎日のブラッシング頻度) に関する情報を収集しました。および前回の歯科受診）。

臨床検査 ベースライン (T0) で、3 人の訓練を受け、校正された検査官が、口腔鏡と手動歯周プローブ (CP11 Hu Friedy、ヨーロッパ) を使用して、患者を歯科用椅子 (A-dec 、ニューバーグ、オレゴン州、米国)。 臨床検査では、Silness & Löe プラーク インデックス (PI)、Löe & Silness 歯肉インデックス (GI)、クリニカル アタッチメント ロス (CAL)、プロービング深度 (PD)、およびプロービング時の出血 (BOP) (インター/イントラ) を評価しました。試験官の信頼度 >80%)。 これらの測定は、すべての歯の 6 つの表面 (舌中央/口蓋、離舌/口蓋、近舌/口蓋、頬側頬側、頬側中央、および近頬側) で実行されました。 抜けた歯の数が記録されました。

サンプル収集手順 T0、T1、および T2 で被験者から歯垢および唾液サンプルを収集しました。 プラークサンプルは、最も深いポケットの読み取り値で歯肉の裂け目から採取され、無菌万能キュレットを使用して臨床部位から除去されました。 唾液排出器を使用してサンプリング領域を分離し、空気で穏やかに乾燥させました。 キュレットの先端を隙間/ポケットの深部に挿入し、歯の表面に接触させながら冠状に動かして、歯肉縁下および歯肉縁上の両方のプラークを除去しました。 次いで、試料をエッペンドルフチューブ（ｅｐＴＩＰＳ Ｓｔａｎｄａｒｄ、エッペンドルフＡＧ、ハンブルグ、ドイツ）中の０．５ｍｌの滅菌蒸留水に浸した。 刺激された唾液サンプルの収集のために、被験者はパラフィンワックスを噛むように要求され、段階的なメスシリンダーに接続されたプラスチック漏斗に吐き出されました。 各被験者から約 3 ml の唾液が採取されました。 収集後すぐに、サンプルチューブを砕いた氷で満たされた容器に入れ、-80℃で保存するために口腔微生物学研究室に輸送しました。

細菌培養 H. pylori JA1 株は、クウェート大学医学部から入手しました。 細菌株は、微好気性条件で摂氏 37 度で、脱繊維ヒツジ血液 (5%) を添加したトリプチケース ソイ アガー上で増殖させました。

DNA精製 唾液とプラークのサンプルは、氷上で実験室に運ばれました。 12000 × g で 1 分間ボルテックスした後、上清を除去し、ペレットを -80°C で保存しました。 DNeasy DNA精製キット（Qiagen、ドイツ）を製造業者の指示に従って使用することにより、ペレットからのDNAを精製した。 簡単に言えば、ペレットを溶解緩衝液およびプロテイナーゼ-Kで摂氏56度で1時間処理した。 溶解したサンプルからのDNAをスピンカラムに適用し、洗浄しました。 ヌクレアーゼを含まない水を使用して精製した DNA を溶出し、NanoDropTM 1000 を使用した UV 分光測光法により DNA 濃度を測定しました。 H. pylori JA1 からのゲノム DNA は、同じ方法を使用して精製されました。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) サンプルから DNA を精製した後、ピロリ菌の量を SYBR Green 定量的リアルタイム PCR 法により、ureA 遺伝子のピロリ菌種特異的プライマー: ureA-F を使用して測定しました。 : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' および ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. qPCR 反応混合物 (25 µl) には、12.5 µl の SYBR Green マスター ミックス (Power SYBR Green® Kit、Applied Biosystems)、1.0 µl のフォワードおよびリバース プライマー (0.4 µM)、5.0 µl の DNA テンプレート、および 5.5 µl の水が含まれていました。 熱プロファイルは次のとおりでした: 95°C で 10 分間の初期変性、95°C で 15 ～ 30 秒間、55°C で 30 秒間、72°C で 30 秒間を 40 サイクル。 蛍光シグナルの取得は、各サイクルの伸長ステップで設定されました。 すべての qPCR 反応は、ABpplied Biosystems® Fast 7500 Real-Time PCR マシンで実行されました。 シーケンス検出システム (SDS) (ソフトウェア バージョン 2.3) をデータ分析に使用しました。 ヘリコバクター ピロリ JA1 の連続希釈ゲノム DNA を反応に使用して、各種の推定細菌細胞濃度 (細胞/mL) に対する Ct 値をプロットし、上記のソフトウェアを使用して標準曲線を作成しました。 すべての測定値は、サンプル、標準、およびコントロールについて 3 通で取得されました。

データ管理と統計分析 さまざまな絶食条件下で TB+M または TB を使用したピロリ菌数の減少は、この研究で関心のある主要な結果でした。 H. pylori に対するミスワクの効果に関する先験的な情報が入手できなかったため、グループ間の H. pylori 数の平均 30% 減少を標準偏差と仮定して、グループ間の 50% の差を検出するようにサンプル サイズを計算しました。 15％の。 80% の検出力と 0.05 のリスク アルファを得るには、グループごとに 17 人の患者が必要でした。 微生物数の差は、T0、T1、および T2 の間で計算されました。 Mann-Whitney U 検定または Kruskal-Wallis 検定 (連続従属変数) およびカイ 2 乗検定 (カテゴリ従属変数) を使用して、2 つのグループ間の一般的な特性の違いを評価しました。 グループ間の H. pylori の分布は、Kolmogorov-Smirnov および Shapiro-Wilk 検定を使用して正規性を調査しました。 データは正規分布していないため、ピロリ菌数の群内変化はウィルコクソン符号順位検定で評価し、群間比較はマンホイットニー U 検定を使用して行いました。 スピアマン試験を使用して、歯垢/唾液サンプル中のピロリ菌数 (1x103cells/mL) とベースラインでの臨床的歯周パラメーターとの相関関係を評価しました。 有意水準はp<0.05に設定されました。 すべての統計分析は、SPSS 26.0 (IBM Corp.、Armonk、NY、USA) を使用して実行されました。