O efeito dos bastões de mascar Miswak na infecção oral por Helicobacter Pylori (Miswak)

Aspectos éticos O protocolo experimental foi aprovado pelo comitê de ética do Health Science Center (HSC) da Kuwait University (VDR/ED/3331) e está registrado em ClinicalTrials.gov como NCT02418520 (16/04/2015). A pesquisa foi conduzida de acordo com os princípios descritos na declaração de Helsinki sobre experimentação médica humana. O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes e é apresentado de acordo com as normas consolidadas das diretrizes de relatórios de estudos (CONSORT).

Desenho do estudo Este foi um estudo experimental com um desenho randomizado, cruzado e simples cego.

Amostra do estudo e coleta de dados Este estudo foi conduzido entre pacientes regulares que frequentam o Centro Odontológico da Kuwait University, Kuwait. O recrutamento de pacientes começou em fevereiro e foi concluído no final de agosto de 2019. A pergunta PICO (P = População de pacientes; I = Intervenção de interesse; C = Intervenção comparativa; O = Resultado) para este estudo foi: "para indivíduos sob diferentes condições de jejum (P), qual é o efeito do uso de bastões de mascar miswak junto com escova de dentes (I) versus usar apenas escova de dentes (C) nas contagens orais de H. pylori (O)?". Os pacientes voluntários foram informados sobre os componentes do estudo e o consentimento informado foi obtido deles. Amostras salivares e de placas foram coletadas para triagem por PCR para detectar a presença de H. pylori. Os critérios de inclusão foram: 1) indivíduos com níveis detectáveis ​​de H. pylori em placas ou amostras salivares; 2) nenhuma evidência de periodontite; e, 3) com pelo menos 24 dentes. Indivíduos que receberam terapia antibiótica ou inibidores da bomba de prótons nos últimos três meses foram excluídos do estudo.

Recrutamento dos participantes do estudo e agrupamento Este estudo incluiu 20 indivíduos que estavam em jejum de 12 horas (grupo de jejum) e 20 indivíduos que não estavam em jejum (grupo sem jejum). Os indivíduos do grupo sem jejum foram recrutados entre fevereiro e abril e os indivíduos do grupo em jejum foram recrutados entre maio e junho de 2018 (mês sagrado do Ramadã). Na linha de base (T0), cada sujeito recebeu números com base na ordem cronológica de inclusão no estudo. Tanto os indivíduos em jejum quanto os não-jejum foram subdivididos aleatoriamente em Grupo-1 e Grupo-2 (n=10 cada). A atribuição aleatória dos sujeitos foi realizada por um resultado binário aleatório de um dado, números pares ou ímpares. Os examinadores não tiveram conhecimento da alocação dos participantes. Os indivíduos do grupo 1 foram instruídos a usar escova de dentes e miswak (TB+M) por duas semanas (T1) e apenas escova de dentes (TB) pelas próximas duas semanas (T2); e os indivíduos do Grupo 2 foram solicitados a usar apenas TB durante T1 e TB+M durante T2, tanto para o grupo em jejum quanto para o grupo sem jejum. Os participantes receberam instruções sobre como usar miswak (pega com cinco dedos, técnica de esfrega, por 15 minutos, duas vezes ao dia21) e TB (técnica de Bass modificada, por dois minutos, duas vezes ao dia) por um único investigador (JKB). Amostras de placa e saliva foram coletadas em T0, T1 e T2.

Questionário Os sujeitos foram entrevistados e coletadas informações sobre suas características sociodemográficas (idade, sexo, escolaridade, emprego e renda), presença de condições médicas selecionadas (hipertensão, diabetes e medicamentos atuais), tabagismo e características dentárias (frequência de escovação diária e consulta odontológica anterior).

Exame Clínico No início (T0), três examinadores treinados e calibrados realizaram os exames clínicos usando um espelho bucal e uma sonda periodontal manual (CP11 Hu Friedy, Europa), com o paciente em posição semi-supina na cadeira odontológica (A-dec , Newberg, OR, EUA). Os exames clínicos avaliaram o índice de placa de Silness & Löe (PI), o índice gengival de Löe & Silness (GI), a perda de inserção clínica (CAL), a profundidade de sondagem (PD) e o sangramento à sondagem (BOP) (inter/intra confiabilidade do examinador >80%). Essas medidas foram realizadas em seis superfícies (mediolingual/palatina, distolingual/palatina, mesiolingual/palatina, distovestibular, mediovestibular e mesiovestibular) de todos os dentes. O número de dentes perdidos foi registrado.

Procedimento de coleta de amostra Amostras de placa e saliva foram coletadas dos indivíduos em T0, T1 e T2. Amostras de placa foram retiradas do sulco gengival na leitura mais profunda do bolso e removidas do local clínico usando uma cureta universal estéril. As áreas de amostragem foram isoladas com ejetores de saliva e suavemente secas ao ar. A ponta da cureta foi inserida nas profundezas do sulco/bolsa, movida coronalmente enquanto em contato com a superfície do dente, para remover a placa sub e supragengival. As amostras foram então imersas em 0,5 ml de água destilada estéril em tubos Eppendorf (epTIPS Standard, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha). Para a coleta das amostras de saliva estimulada, os sujeitos foram solicitados a mastigar cera de parafina e expectorar em um funil plástico conectado a uma proveta graduada. Cerca de 3 ml de saliva foram coletados de cada sujeito. Imediatamente após a coleta, os tubos de amostra foram colocados em um recipiente com gelo moído e transportados para o laboratório de Microbiologia Oral para preservação a -800C.

Cultura bacteriana cepa H. pylori JA1 foi obtida da Faculdade de Medicina, KUWAIT University. A cepa bacteriana foi cultivada em ágar de soja tripticase suplementado com sangue de carneiro desfibrinado (5%) a 37 graus Celsius em condições microaerófilas.

Purificação do DNA Amostras de saliva e placas foram trazidas ao laboratório em gelo. Após agitação em vórtex por 1 minuto a 12.000 × g, o sobrenadante foi removido e os pellets foram armazenados a -80°C. O DNA dos pellets foi purificado usando um Kit de purificação de DNA DNeasy (Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os pellets foram tratados com tampão de lise e proteinase-K a 56 graus Celsius por 1 h. O DNA das amostras lisadas foi aplicado em uma coluna giratória e lavado. O DNA purificado foi eluído usando água livre de nuclease e as concentrações de DNA foram medidas pelo método de espectrofotometria UV usando NanoDropTM 1000. O DNA genômico de H. pylori JA1 foi purificado usando o mesmo método.

Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) Após a purificação do DNA das amostras, as quantidades de H. pylori foram medidas pelo método de PCR quantitativo em tempo real SYBR Green usando primers específicos da espécie de H. pylori para o gene ureA: ureA-F : 5'-CGTGGCAAGCATGATCCAT-3' e ureA-R: 5'- GGGTATGCACGGTTACGAGTTT-3' 44. A mistura de reação qPCR (25 µl) continha 12,5 µl de SYBR Green master mix (Kit Power SYBR Green®, Applied Biosystems), 1,0 µl de primer direto e reverso (0,4 µM), 5,0 µl de modelo de DNA e 5,5 µl de H2O. O perfil térmico foi o seguinte: uma desnaturação inicial a 95°C por 10min, 40 ciclos de 95°C por 15-30s, 55°C por 30s e 72°C por 30s. A aquisição do sinal fluorescente foi definida na etapa de alongamento de cada ciclo. Todas as reações de qPCR foram executadas na máquina de PCR em tempo real ABpplied Biosystems® Fast 7500. Sistemas de Detecção de Sequência (SDS) (software versão 2.3) foram usados ​​para análise de dados. O DNA genômico diluído em série de H. pylori JA1 foi usado nas reações para traçar os valores de Ct contra a concentração de células bacterianas deduzidas (células/mL) para cada espécie e para construir curvas padrão usando o software acima. Todas as medições foram feitas em triplicado para amostras, padrões e controles.

Gerenciamento de dados e análise estatística Uma redução na contagem de H. pylori usando TB+M ou TB em diferentes condições de jejum foi o principal resultado de interesse neste estudo. Como nenhuma informação a priori sobre o efeito de miswak em H. pylori estava disponível, o tamanho da amostra foi calculado para detectar uma diferença de 50% entre os grupos, assumindo uma redução média de 30% nas contagens de H. pylori entre os grupos, com um desvio padrão de 15%. Para obter um poder de 80% e um alfa de risco de 0,05, foram necessários 17 pacientes por grupo, que foram arredondados para 20, para contabilizar possíveis desistências. A diferença nas contagens microbianas foi calculada entre T0, T1 e T2. O teste U de Mann-Whitney ou o teste de Kruskal-Wallis (variável dependente contínua) e o teste qui-quadrado (variável dependente categórica) foram usados ​​para avaliar as diferenças nas características gerais entre os dois grupos. A distribuição de H. pylori entre os grupos foi explorada quanto à normalidade usando os testes Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk. Os dados não foram distribuídos normalmente, portanto, a alteração intragrupo nas contagens de H. pylori foi avaliada com o teste de postos sinalizados de Wilcoxon e as comparações intergrupos foram feitas usando o teste U de Mann-Whitney. O teste de Spearman foi usado para avaliar a correlação entre as contagens de H. pylori (1x103células/mL) em amostras de placa/salivar e os parâmetros clínicos periodontais no início do estudo. O nível de significância adotado foi p<0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando SPSS 26.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EUA).