评估氯喹治疗越南中部间日疟原虫感染的疗效

3.1 研究设计本研究设计为为期 42 天的药物疗效研究，以评估间日疟原虫疟疾感染治疗后的临床和寄生虫学反应。 符合研究标准的有症状的间日疟原虫单一感染患者将被纳入研究，并接受 CQ 治疗（总剂量 25gm/kg，超过 3 天）。 将直接观察治疗，并根据扩展的 WHO 方案对患者进行 42 天的积极随访。 在随访时间结束时，所有患者都将按照根治间日疟原虫感染的国家指南接受伯氨喹治疗。

3.2 研究地点和人群 本研究将在嘉莱省Krong Pa区进行，该地区恶性疟和间日疟的发病率均位居全国前列。 该研究将位于 Chu'R Cam 公社，研究小组将在那里与当地卫生人员和所有周边有疟疾患者的公社合作。

当地人口主要由 JaRai 少数民族组成，主要职业包括林地刀耕火种（主要是玉米、木薯和水稻），以及橡胶园的季节性工作和日常用品的小规模生产生存或贸易，例如 咖啡和腰果。 气候为热带气候，11 月至 4 月为旱季，5 月至 10 月为雨季。 该地区是丘陵和森林（次生林），主要的疟疾媒介是按蚊。

3.4 试验人群 目标人群包括所有间日疟原虫感染患者（儿童和成人），这些患者要么自发出现在 CHC 中，要么通过社区主动筛查确定。

3.5 试验程序 3.5.1 筛选和招募 所有在筛选期间符合基本入组标准的咨询患者将被分配一个连续的筛选编号，并由医生进行更深入的评估。 一旦患者符合所有入组标准，他或她（或儿童的父母或监护人）将被征求同意参与研究。 然后，他/她将被分配一个学习编号（ID=顺序编号）。 任何决定不参加研究的人将由卫生机构工作人员根据卫生部制定的护理标准进行检查、治疗和随访。

在入组时（第 0 天），将对患者进行检查并填写标准化的预编码问卷。 将在入组时将所有患者的静脉血样收集到含有 EDTA 或柠檬酸葡萄糖 (EDTA/ACD) 的无菌真空采血管中。 从成人身上采集最少 5 毫升的血液，最多采集 8 毫升的血液，从儿童身上采集 1 毫升/千克最多 5 毫升的血液。 将两滴血加入含有 500 µL RNAprotect 试剂 (Qiagen) 的 1.5 ml 试管中。

3.5.2 治疗 所有患者将在 3 天内并在直接监督下接受 CQ 的全面治疗，剂量为每公斤体重 (bw) 25 mg CQ。 治疗后将观察患者 60 分钟是否有不良反应或呕吐。 那些在前 30 分钟内呕吐药物的患者将接受重复的全剂量；呕吐30-60分钟者减半。 如果患者再次呕吐，他或她将被撤回并提供抢救治疗。

救援药物：

口服=CQ（3 天，25mg/kg）连同伯氨喹（0.25mg/kg/天，持续 14 天）；静脉注射 (IV)= 青蒿琥酯（4mg/kg/天）至少 24 小时，直到患者能够口服药物。 然后继续口服 DHA-PPQ 3 天。

根治性治疗。 伯氨喹治疗将延迟到随访结束，并按照国家指南的建议给予，即对所有G6PD快速检测阴性的患者给予0.25mg/kg/天，持续14天。

3.5.3 从第 0 天到寄生虫清除患者将通过血液显微镜每 12 小时进行一次随访，至少到第 3 天，如果需要则更长时间，直到寄生虫清除被定义为两个连续的阴性载玻片。

每次就诊时，将对患者进行访谈和检查，并采集手指刺血样本以获得以下结果：两张血片用于 LM 观察（厚膜和薄膜），EDTA/ACD 微量采管中的 200 微升血液用于 DNA提取，并将 2 滴血液放入另一个含有 RNAprotect 的微量采管中用于 RNA 提取。 在第 3 天，将额外采集一滴血以使用 Hemocue 方法测量 Hb 浓度。

第 7、14、21、28、35、42 天将对患者进行面谈和检查，完成随访表，并记录任何不良事件。 将采集手指刺血样本以获得以下结果：两张用于 LM 观察的血玻片（厚膜和薄膜）、200μl 血液在 EDTA/ACD 微量采管中用于 DNA 提取，以及 2 滴血液在含有 RNAprotect 的微量采管中.

此外，在第7天，将取100μl血液放在滤纸上以确定血液CQ浓度。 在第 7、14、28 和 42 天，Hb 浓度 (Hemocue) 将通过手指采血测量。

间日疟原虫复发日：如果确认复发，将在实施救援治疗之前进一步采集静脉血样。 将 100μl 这种静脉血点在滤纸上以确定血液 CQ 浓度，其余用于体外测定和冷冻保存，详见附件 VI-C。

3.5.4 失访 失访 失访发生在尽管做出了所有合理努力，但登记的患者没有参加预定的访视并且找不到。 没有治疗结果将分配给这些患者。 这些患者将被归类为失访并被审查或排除在分析之外。

符合以下任何标准的研究患者将被归类为退出：i) 退出同意； ii) 未能完成治疗； iii) 在整个疗程完成之前需要终止治疗的严重不良事件； iv) 违规注册； v) 自愿违反协议； vi) 非自愿违反协议

3.5.5 实验室程序和评估 显微镜检查 筛选时应获得三张载玻片（薄/厚血涂片），其中一张快速染色（10% 吉姆萨染色 10 分钟）以在有限的视野中检查以确保存在间日疟原虫无性型寄生虫血症至少为 250/ul。 患者入组后，其他两张幻灯片将被更仔细地染色（3% 姬姆萨染色 45 分钟）。 密度，将表示为每微升血液中无性寄生虫的数量，计算方法是将无性寄生虫的数量除以计算的白细胞数量，并根据估计的白细胞密度（通常为每微升 8000 个）进行校正。 当无性寄生虫计数低于每 200 个 WBC 10 个时，将至少对 500 个 WBC 进行计数。 当检查 1000 个白细胞未发现无性寄生虫时，血片将被视为阴性。

• 环期寄生虫血症：将在第 0 天和复发日对 200 个无性寄生虫的所有阳性载玻片中的环期数进行计数；只有环阶段比例超过 65% 的分离物才会用于体外药物测定。
• 配子体：密度将通过计算每 500 个 WBC 中配子体的数量来计算。

血红蛋白水平 Hb 水平将按照制造商的说明使用 Hemocue 对收集到微试管中的全血进行测量。

在第 7 天和复发当天从排出到层析纸（31ETCHR，Whatman）的 100 微升血液中测量 CQ 浓度 寄生虫分子检测和基因分型 DNA 将在 ITM/NIMPE 从微量容器中收集的手指刺血样本中提取。 第 0 天疟原虫物种的分子确认将通过针对 18S 核糖体基因的 qPCR 进行。 相同的 qPCR 方法将用于在第 0 天识别和量化 P. vivax 感染并跟踪样本。

间日疟原虫基因型将通过 3 种标记物的 PCR 扩增来鉴定，这些标记物对临床试验中的指纹识别特别有效（MS16、Pv3.2 和 msp1F3），然后进行毛细管凝胶电泳。

配子体的 RNA 提取和 RT-qPCR 将使用亲和柱和基因组 DNA 的 DNAse 消化从 ITM/NIMPE 的 RNAprotect 样品中提取 RNA。 为了检测和量化间日疟原虫配子体阶段，将在 D0 和所有后续样本中进行针对 Pvs25 基因转录物的逆转录 qPCR (RT-qPCR)。

耐药性实验室分析（第 0 天和复发后） 简言之，将血液离心并将血浆储存在 -20ºC。 小心去除血沉棕黄层的上部并在 -20ºC 下保存。 将红细胞 (RBC) 重悬于 PBS (1:1) 中，并使用纤维素柱 (Sigma) 去除白细胞。 在以 50% 血细胞比容重悬于 McCoy 培养基（血液培养基混合物，BMM，4ml）之前，将洗涤过滤后的细胞并测量沉淀。

离体药物敏感性测定：简言之，将按照 WWARN 程序 [http://www.wwarn.org/sites/default/files/INV08_PFalciparumDrugSensitivity .pdf]。 将使用 WWARN 在线开发的体外分析和报告工具 (IVART) 计算最小抑制浓度和 IC50。

G6PD 缺乏症测试：在 PQ 治疗之前，所有患者都将使用 CareStart（Access Bio，新泽西州，美国）的即时测试来测试 G6PD 缺乏症。

4. 将定期安排质量保证现场监督访问。 在这些访问期间，记录在病例报告表上的信息将根据源文件进行验证。 在试验结束时整理病例报告表后，将对其完整性和准确性进行审查。 数据将被双重输入电子数据库，其中使用专门设计的计算机检查来识别选定的协议违规和数据错误。

所有入院时的血片都将在研究地点以及协调中心的高级显微镜师处读取。 此外，ITM 将对 10% 随机选择的载玻片进行外部质量控制。 对于每项分子检测（qPCR、RT-qPCR 和寄生虫基因分型），将随机选择 10% 在 NIMPE 处理的样本在 ITM 进行重新分析。体外药物检测结果的外部质量控制将在 ITM 进行，在那里将重新检查载玻片以寻找 10% 的随机选择的分离株。

5. 统计分析计划 将对意向治疗 (ITT) 患者群体和可评估患者群体（根据方案）进行第 42 天治愈率的分析。 将使用 STATA 12 软件进行数据分析。 对于分类变量，百分比和相应的 95% 置信区间将按照 Wilson 方法计算。 将通过 Yates 修正计算 *2 或在适当情况下通过 Fisher 精确检验来比较比例。 正态分布的连续数据将通过学生 t 检验和方差分析进行比较。 不符合正态分布的数据将通过 Mann-Whitney U 检验或 Kruskal-Wallis 方差分析进行比较。 将根据需要使用 Pearson 或 Spearman 等级相关系数评估 2 个连续变量之间的相关性。

第 28 天和第 42 天治疗失败的总体风险将通过 Kaplan Meier 方法计算，风险组之间的比较将使用对数秩检验进行。 第 28 天和第 42 天的 PCR 调整风险也将根据每个复发性间日疟原虫感染的基因分型结果进行计算。 将使用 WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/parasite-clearance-estimator) 开发的 PCE 在线工具估计寄生虫清除时间和速率。 将使用 WWARN (http://www.wwarn.org/toolkit/data-management/ivart) 开发的体外分析和报告工具 (IVART) 估算 CQ 的平均 IC50 和 IC90。

通过分别测量第 0、3、7、14、28 和 42 天之间 Hb 浓度的变化来评估血液学变化。

6. 伦理问题 6.1 进行研究的伦理许可已从河内 NIMPE 伦理委员会和安特卫普大学伦理委员会以及安特卫普 ITM 机构审查委员会获得。

6.2 同意过程 只有患者（或儿童的父母或监护人）给予知情同意，患者才会被纳入研究。 同意请求以英文提供，并翻译成越南语，以供患者、父母或监护人完整阅读。 将解释有关试验及其好处和潜在风险的详细信息。 回答任何问题后，将要求在文档上签名。 如果患者不识字，必须有识字的见证人签字；如果可能，签字人将由参与者选择，与研究团队无关。